ISSR分子标记在植物研究中的应用概况【文献综述】.docVIP

毕业论文文献综述 生物技术 ISSR分子标记在植物研究中的应用概况 摘要：文章介绍了ISSR分子标记技术的原理及特点，用ISSR分子标记技术实验的基本研究方法，以及ISSR分子标记技术在不同植物种质资源研究中的应用现状等。最后，对ISSR分子标记技术在植物种质资源研究方面的发展做了展望。 关键词：ISSR；分子鉴定；遗传多样性；品种鉴定；应用 ISSR(inter-simple sequence repeat)是一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记技术，由加拿大蒙特利尔大学Zietkiewiez等[1]在1994年创建，它的基本原理是在SSR的3’或5’端锚定2-4个碱基做引物，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。 1.ISSR分子标记的特点 ISSR分子标记技术兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点，与SSR相比，ISSR不需要预先获知序列信息而使成本降低[2]，且多态性更丰富；与RAPD相比，ISSR重复性高，稳定性好，同时具备RAPD的简便、易操作等特点；与RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、成本较低、DNA用量小、安全性较高[3,4]。因此在多种植物的品种鉴定、遗传多样性分析、基因定位、遗传图谱的构建等方面已得到了广泛的应用。 2.ISSR基本研究方法 2.1 基因组DNA的提取与检测 取收集到的几种相似茶花的叶片干燥后，用改良的CTAB法[5-14]提取叶片DNA，NDA通常不用纯化，但需用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量与浓度，浓度需相同。稀释后-20℃保存备用。 2.2 PCR扩增 根据相关文献设计多条PCR引物，由上海生物公司合成。拿到引物后进行预实验，进行引物筛选，筛选出扩增带型清晰且重复性好的引物序列做进一步研究。 经预实验优化实验条件，以确定最终反应条件，即PCR反应体系及PCR扩增程序。 PCR产物在3%的琼脂糖凝胶上120V电压下电泳约1.5h后，用凝胶成像系统拍照保存。 2.3 结果分析 根据得到的电泳图，人工读取上面的条带，然后把有条带记为1，无条带记为0，建立原始矩阵。随后采用P0PGEN32软件分析数据，分别获得茶花品种间的多态性位点数、多态性位点率(PPL)、Nei’s基因多样性指数(H)、遗传相似系数(Hs)等[8,15]。再用NTsys 2.10软件基于Nei′s无偏估计的遗传相似性按UPGMA法进行品种间的聚类分析，绘制出品种间的亲缘关系树状图，由此将品种分类。 3. ISSR分子标记在植物种质资源研究中的应用 ISSR分子标记技术在植物种质资源研究方面的应用已非常广泛，包括遗传相似性研究、品种鉴定以及遗传图谱的构建等。以下是ISSR分子标记技术在许多不同物种中的应用。 3.1 ISSR分子标记在槐树品种鉴定中的应用 冷言峰[6]等人运用ISSR分子技术对香花槐、龙爪槐、刺槐和红花槐4份相似槐树材料进行了品种鉴定和聚类分析，主要目的是鉴别香花槐和红花槐是否“同物异名”。从50条ISSR引物中筛选出19个条带清晰且重复性高的引物，扩增得到了224条带，其中多态性条带214条，占95.5%。结果表明各槐树之间的相似性系数在0.18-0.91之间，香花槐和红花槐之间的相似系数最大，为0.91。4种槐树在DNA分子水平上的差异较明显，据此可初步认为香花槐和红花槐不存在同物异名现象。 该实验证明ISSR-PCR在品种资源的研究中具有较大的应用潜力，同时也得到ISSR检测出的位点数目较多这个优点。 3.2 ISSR分子标记在芍药栽培品种鉴定中的应用 于恒秀[16]等人采用ISSR引物标记技术，初步分析了8个芍药栽培品种：莲台、紫霞映雪、妒花魁、粉玉奴、蓝田碧玉、紫金龙、鱼鳞红、合欢娇、红莲等之间的亲缘关系。5条引物共扩增出21条谱带，亲缘指数分析表明：蓝天碧玉与其余的七个品种之间的关系较远，其次是粉玉奴。该实验还得出，影响扩增反应结果清晰、准确的主要因素有退火温度、Mg2+浓度、Taq酶等，提醒我们在今后的实验中可特别注意这几个因素。 3.3 ISSR分子标记在桉树遗传多样性中的应用 张党权[14]等人以桉树的赤桉、巨桉、细叶桉和粗皮桉4个主要栽培种的l8个种源作为研究材料，根据优化的ISSR-PCR反应体系和扩增条件，从100条引物中筛选出12条扩增条带特异、条带数适中、背景清晰、重复性好的引物，总计扩增出120条清晰可重复的DNA条带，其中93条是多态性条带。每个引物可扩增的多态条带长度范围为300～2500 bp，数目在4～11条，平均为7.75条，多态带百分率为77.5% 。Nei 遗传距离和遗传一致