建立瞬时转染细胞模型检测乙型肝炎病毒表型耐药-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

福建医科大学3硕士学位论文 目 录 缩略词表1 中文摘要2 英文摘要5 前言8 第一部分 建立基于瞬时转染细胞模型的 HBV 表型耐药检测方法 材料和方法 12 1. 研究对象12 2. 主要试剂与仪器13 3. 方法15 结果26 1. HBV 全基因组的扩增.…26 2. HBV 全基因组的 TA 克隆 26 3. 含 1.1 倍 HBV 全基因组重组载体的构建.… 28 4. 瞬时转染细胞模型的建立…….…31 5. 表型耐药检测………33 讨论35 第二部分 HBV 突变株比例不同的准种群耐药规律性的研究 材料和方法 39 1. 研究对象39 2. 主要试剂与仪器39 3. 方法41 结果43 1. 定点突变构建 rtM204V 重组质粒43 2. 体外准种群的表型耐药检测44 讨论50 结论54 参考文献55 综述59 致谢69 福建医科大学 PAGE 1硕士学位论文 缩略词表 缩写 英文全称 中文全称 HBV hepatitis B virus 乙型肝炎病毒 CHB chronic hepatitis B 慢性乙型肝炎 NAs nucleos(t)ide analogues 核苷（酸）类似物 LMV lamivudine 拉米夫定 ADV adefovir dipivoxil 阿德福韦酯 ETV entecavir 恩替卡韦 TDF tenofovir disoproxil 替诺福韦酯 LdT Telbivudine 替比夫定 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 rpm rotate per minute 每分钟转速 dNTP deoxyribonucleoside triphsphate 脱氧核苷三磷酸 Taq thermus-aquaticus DNA 耐热 DNA 聚合酶 polymerase bp base pair 碱基对 HBsAg hepatitis B surface antigen 乙型肝炎病毒表面抗原 IPTG isopropylthio-β-D-galactoside 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 ORF open reading frame 开放读码框 RT reverse transcriptase 逆转录酶 IC50 half maximal inhibitory 半数抑制浓度 concentration EC50 FR half maximal effect concentration fold resistance 半数有效浓度 耐药倍数值 s second 秒 min minute 分 h hour 小时 d day 天 1 建立瞬时转染细胞模型检测乙型肝炎病毒表型耐药 中文摘要 目的 1 建立一种基于瞬时转染细胞模型的 HBV 表型耐药检测方法，并评价该方法 的应用价值。 2 使用表型耐药检测技术对体外准种群进行耐药分析，探讨突变株比例不同的 HBV 准种群的耐药规律性。 方法 1 建立基于瞬时转染细胞模型的 HBV 表型耐药检测方法 在入选 CHB 患者标本中筛选出含 HBV 野生株及突变株的血清标本各 1 例，并从中分离 HBV DNA，使用全基因扩增技术在体外大量扩增 HBV 全基 因组。利用 BspQ I 酶对真核表达载体 pHY106 以及包含 HBV 全基因组的 pEASY-Blunt T 载体进行酶切消化，并经连接、转化等步骤从单克隆菌落中筛 选出正确连接 HBV 全基因组的转化子，构建重组真核表达载体 pHY-CL 与 pHY-ZJ。大量提取重组质粒载体，并将上述两组质粒瞬时转染至 HepG2 细胞 中，细胞培养后检测培养体系上清液中 HBV DNA，以验证瞬时转染细胞模型 的成功构建。以相同的转染方法分别转染两组质粒并在转染后的培养体系中， 添加拉米夫定溶液使体系终浓度分别达到 0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、 10μM、100μM，测定在各种药物浓度下 HBV DNA 水平的改变并计算出 IC50， 以评价 HBV 野生株与突变株的药物敏感性。 2 HBV 准种群的表型耐药检测与耐药规律性分析 使用定点突变方法诱导野生型重组质粒产生 rtM204V 点突变，将野生型 质粒和经点突变的 rtM204V 突变型质粒混合，突变型质粒所占比例设定为 0%、 20%、40%、60%、80%、100%，以完成构成体外逆转录酶区准种群。不同比 例组成的准种群分别转染至 HepG2 细胞中，检测在各种药物浓度下 HBV DNA 水平的改变，并计算出各准种群的 IC50。探讨不同比例组成的 HBV 准种群在 2 体外表型耐药的变化规律，评价表型耐药检测技术在 HBV 准种群耐药检测领 域的应