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果梅CCoAOMT蛋白Western-blot体系建 立与优化 张勇侍婷吴欣欣高志红 南京农业大学园艺学院 摘要： ［目的］本文旨在建立一套适合于果梅（Prunus mume） Western-blot的蛋口质提 取和技术体系。［方法］以果梅品种小绿萼花芽为试验材料，以咖啡酰辅酶 A-0-甲基转移酶（CCo A0MT）为目标蛋白，分别采用Tris-HCl法和SDS上样缓 冲液直接提取法，比较2种提取方法的优劣，并通过设置不同的蛋白上样量 （20、30、40、50及60 ug）、转膜时间（40、60及90 min）、一抗稀释比例 （1 : 500、1 : 1 000、1 ： 2 000及1 ： 5 000）以及一抗孵育时间（室温1 h、室 温2 h及4°C过夜）等组合，研究适合果梅花芽CCo A0MT蛋白Western-blot的 最佳体系。［结果］成功建立了快速、灵敏、特异的Western-blot体系，确定了 果梅花芽CCoAOMT蛋白的Western-blot试验条件。SDS上样缓冲液直接提取法 提取蛋白快速、高效，最佳条件为以蛋白上样量30ug.转膜1 h、一抗稀释比 例1 ： 1 000以及一抗孵育2 ho ［结论］本试验建立了简单、快速和重复性好的 SDS上样缓冲液直接提取法以及优化的上样量、转膜时间和抗体浓度等 Western-blot体系，为梅等木本植物开展Western-blot研究提供依据。 关键词： 果梅;花芽;蛋白提取;咖啡酰辅酶A-0-甲基转移酶（CCoAOMT）; Western-blot; 作者简介：张勇，硕士研究生。 作者简介：高志红，教授，主要从事果树生物技术研究， E-mail:gaozhihjau. edu. cno 收稿日期：2017-02-13 基金：国家自然科学基金项Fl Establishment and optimization of Western-blot system for CCoAOMT protein in Prunus mume ZHANG Yong SHI Ting WU Xinxin GAO Zhihong College of Horticulture, Nanjing Agricultural University; Abstract： [Objectives]The paper aims to establish the method which is appropriate for protein extraction and Western-blot analysis of Prunus mume. [Methods]We used flower buds of Prunus mume Xiaoltic as the plant material and Pm CCoAOMT as the target protein. Tris-HCl method and SDS loading buffer method were used to extract flower bud protein, respectively. Furthermore, we analyzed advantages and disadvantages of two methods by compar ing Tris-HCl met hod with SDS loading buffer method. In order to study the optimum Western-blot system for CCo AOMT protein of Japanese apricot, different weights of protein samples ( 20, 30, 40, 50 and60 P g) , transmembrane time ( 40, 60 and 90 min) , primary antibody concentration ( 1 : 500, 1 : 1 000, 1 : 2 000 and 1 : 5 000) and incubation time of primary antibody ( at room tempereiture for 1 h, at room temperature 2 h and at 4 °C for overnight) were tested. [RcsultsjThc rapid, sensitive and specific Western-blot system has been established successfully, and the experimental Wes