分子生物学研究法.ppt

第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 3. 体外蛋白质相互作用技术 蛋白质芯片技术 蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的 相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质 芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可 以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相 互作用蛋白点。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 3. 体外蛋白质相互作用技术 等离子表面共振技术 将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米 级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过 时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折 射率上升，导致共振角度的改变。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 3. 体外蛋白质相互作用技术 免疫共沉淀技术 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可 能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入 反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法 在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合 物沉淀到试管的底部或微膜上。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 4. 细胞内蛋白质相互作用研究——荧光共振能量转移法（FRET） FRET荧光能量转移有三个基本条件： 给体与受体在合适的距离（1～10 nm）； 给体的发射光谱与受体的吸收光谱有 一定的重叠（这是能量匹配的条件）； 给体与受体的偶极具有一定的空间取 向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 5. RNAi（RNA干涉）技术及其应用 RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解 细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的命名来源于安德鲁·法尔1998年在《自然》杂志上的 论文。 研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引 发与之互补的单链RNA（ssRNA, single- stranded RNA）的降解。 经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸 酶）的加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以上）首先被降解形成21～25个核苷 酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA ），并有效定位目标 mRNA。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 * 南京农业大学 生命科学学院 * RNAi作用机 制示意图。 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 5. RNAi（RNA干 涉）技术及其应用 siRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性 RNA降解的重要中间媒介，它具有特殊的结 构特征，即5’端磷酸基团和3’端的羟基，其 两条链的3’端各有两个碱基突出于末端。 由siRNA中的反义链参与指导合成被称为 RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白 体，再由RISC介导切割目的mRNA分子中与 siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶 基因表达的功能。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 第四节 基因芯片及数据分析 基因芯片及数据分析 基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列 （DNA microarray）技术是能同时监测大量靶 基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录 本的变化规律。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 * 南京农业大学 生命科学学院 * 基因芯片及数据分析 简易基因芯片 使用机械臂把DNA片段点在玻璃片或尼龙膜 上，经过物理吸附作用达到固定化。也可以 直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得到 寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的cDNA 或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处 理，便可以观察到大规模的基因群在不同组 织或同一组织不同发育时期或不同生理条件 下的表达模式。 基因芯片可用于进行基因诊断。先建立正常人 特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信 号图，用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，确 定哪些基因的表达受抑制或激活。 * * 南京农业大学 生命科学学院 第五节 其他分子生物学技术 1. 凝胶滞缓实验 凝胶滞缓试验（gel retardation assay）， 又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质 相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA 朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反 比。如果此时DNA分子与某种蛋白