常用实验技术.docVIP

实验室常用实验技术 实验室常用实验技术目录 分子生物学： 基因型鉴定朴春梅 组织DNA提取马斐斐 总RNA提取、浓度的测定张祎 RT-PCR技术朴春梅 Real-time RT-PCR张聪聪 3D共培养细胞RNA提取王颖 质粒构建及转染技术邱淑兰 腺病毒的扩增及纯化徐鸣 Western Blot（免疫印迹法）郭俊 马斐斐 组织、细胞蛋白提取 3D共培养细胞蛋白提取 蛋白定量 Western Blot 细胞生物学： 细胞复苏、细胞计数、体外传代、细胞培养及冻存张晶 细胞增殖检测方法刘旭霞 原代细胞培养技术 骨髓巨噬细胞提取培养郑娇 腹腔巨噬细胞提取培养潘丽丽 乳鼠心肌细胞、成纤维细胞分离培养刘旭霞 脐静脉内皮细胞分离培养王颖 骨骼肌成纤维细胞、成肌细胞原代分离徐鸣 骨骼肌单纤维的原代分离徐鸣 Transwell小室的使用马斐斐 siRNA细胞转染技术潘丽丽 组织病理学技术 HE染色苗艳菊 MASSON染色韩雅蕾 天狼星红染色韩雅蕾 WGA染色屈超 石蜡切片免疫组化染色刘婷婷 郑娇 冰冻切片的免疫组化染色咸瑛琳 免疫荧光染色技术 细胞免疫荧光染色张晶 冰冻切片免疫荧光技术朱芙丽 苗艳菊 细胞凋亡荧光染色与观察（TUNEL）张祎 流式细胞术 肌肉细胞悬液制备与染色徐鸣 肿瘤细胞悬液制备与染色蔡伦 人大隐静脉血管平滑肌细胞单细胞悬液制备王颖 ELISA戴璐 小动物活体实验 小动物成像朴春梅 多孔板成像朴春梅 小动物超声刘旭霞 小鼠洁净刘婷婷 鼠尾套管法测血压吴依娜 （一）分子生物学 基因型鉴定 朴春梅 基因型鉴定基本操作流程 1、出生3-4周小鼠，应及时进行基因型鉴定。 2、准备干净手术用剪刀、镊子、E-tube。 3、轻轻固定小鼠后，用干净手术用剪刀，剪小鼠尾巴3-5mm，用干净镊子夹入E-tube。 4、用消毒纱布，按压小鼠尾部止血，放回小鼠笼子。 5、用消毒酒精，擦干手术用剪刀、镊子，进行下一只。 6、已剪尾巴，如不及时处理，应存于-20℃。 7、小鼠尾巴消化液，加入蛋白酶K（1%），在56℃过夜。 8、85℃变性30-40min，如不及时处理应存于-20℃。 9、按各个基因型具体条件进行PCR（详见PCR技术）。 模板 1-2μl 引物各加 1μl 2X Master MIX 10μl 3DW 5-7μl Total 20 ul 10、电游、成像（详见PCR技术）。 组织DNA提取 马斐斐 取鼠尾2-4mm，加入蛋白酶K30ul与TENS600ul； 56℃加热过夜； 13000rpm4℃离心10min； 取上清于新EP管中； 每管中加入酚600ul，震荡1分钟，冰上静置10分钟； 13000rpm4℃15-20分钟； 取上清，加氯仿600ul，震荡静置10分钟； 13000rpm4℃15-20分钟； 取上清，加入无水乙醇1ml，上下震荡，致出现絮状沉淀，静置13000rpm4℃15分钟； 10、弃上清，加75%乙醇1ml，弹起沉淀物，离心后弃上清，重复2次，12000rmp,18分钟； 11、风干2分钟 12、加灭菌水100ul，-20℃保存。 总RNA提取、浓度的测定 张祎 实验目的 用Trizol抽提法从动物新鲜组织或细胞制备总RNA的实验技术，以及用紫外分光光度法检测RNA的纯度及定量，为Northern blot、RT-PCR、Dot blot、分离mRNA、RNase保护分析、体外翻译、cDNA克隆、基因表达芯片分析、高通量测序等提供基础。 实验试剂及仪器 氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、无水乙醇、冷PBS、1.5ml、灭酶枪头、一次性手套、EP管架、 HYPERLINK /yp/product-list-963.html \t _blank 吸管、冷冻 HYPERLINK /yp/product-list-47.html \t _blank 离心机4℃预冷，眼科镊，眼科剪（组织用） 实验步骤 组织： 1、将器械，组织管，匀浆器钻头提前用DEPC水浸泡过夜。灭酶EP管编号。 2、将新鲜组织剪切成黄豆大小的块，或冻存于液氮的样品（在离体后应迅速冷冻在液氮中,也可加入保存）置入组织管内，加入500μL Trizol，用匀浆器充分研碎组织。使用后的匀浆器钻头分别置于2管75%乙醇（DEPC水配制），2管DEPC水中空转后方可进入下一组织浆中。 3、吸出研碎的粉红色匀浆至EP管内，室温静置10-15min。 4、加入200μL氯仿，使用震荡器震荡为乳糜样，12000rpm离心15min。 5、EP管内可见分为水样层，中间层和有机层，吸取上层水样层至新EP管内。 6、加入500μL异丙醇，上下混匀，室温静置10min，12000rpm离心15min。 7、