基于核酸适配体-金纳米粒子比色传感器快速检测食品中赭曲霉毒素A.docxVIP

基于核酸适配体-金纳米粒子比色传感器快速检测食品中赭曲霉毒素A 　　摘 要：本研究以核酸适配体为识别元件实现对赭曲霉毒素A的高选择性识别，以及采用金纳米粒子做为比色探针，建立了适用于OTA快速检测的比色适配体传感器。研究结果表明，该比色传感器对OTA具有较高的灵敏度和特异性，操作简单快速，能用于实际食品样品中OTA的快速筛查检测；该比色传感器在520nm和650nm下吸光度的比值与OTA浓度在～5μM的范围内呈线性相关，检测限为μM。　　关键词：核酸适配体 金纳米粒子 比色传感器 赭曲霉毒素A　　前言　　赭曲霉毒素是由多种曲霉和青霉菌产生的一类化合物，包括赭曲霉毒素A、B、C、D，4种结构类似的化合物，其中毒性最大、与人类健康关系最密切、对农作物的污染最重、分布最广的是赭曲霉毒素A[ 1 ]。OTA以污染粮谷类农作物为主，但相继有报道指出，许多其他种类的食品中也检测出了OTA，如水果、葡萄酒、啤酒、咖啡、可可和巧克力、中草药、调味料等多种植物产品和食品。由于生物蓄积作用，如许多动物性食品尤其是肾脏、肝脏、肌肉、血液，以及乳和乳制品中常有OTA检出[ 2 ]。　　OTA在食品中的含量通常较低，但较低含量时就可危害人体健康，因此建立一种具有一定灵敏度与专一性，且简便实用，便于推广的OTA快速检测方法具有重要意义。目前应用最广泛的OTA检测方法是高效液相色谱法及高效液相色谱质谱联用法[ 3 ]，但这些方法存在着前处理复杂，样品提取繁琐、净化过程及检测周期长、仪器昂贵、检测成本高等缺点，而无法用于大量样本的快速筛查。　　核酸适配体是新近发展起来的一类由指数富集配基系统进化技术筛选产生的单链DNA或RNA片段，能特异性地结合小分子蛋白质、多肽、有机物、金属离子等各种配体，其作为识别分子在医疗诊断、环境检测、基础分析等多种技术中得到了广泛应用。金纳米粒子具有独特的光学特性，小粒径金纳米粒子水溶胶一般呈红色，当金纳米粒子由于外在的作用发生聚集时，其吸收峰将变宽并发生红移，其颜色也由红色变为蓝紫色。依据这一现象，将以核酸适配体为识别元件与以金纳米粒子为比色探针相结合，构建的适配体比色探针广泛地用于各种生化检测，检测目标包括生物大分子、癌细胞、金属离子以及有机小分子[4]。　　本研究开发了一种“双链复合物”模式的比色探针，通过核酸适配体将金纳米粒子连接在一起发生团聚，随着OTA与核酸适配体的结合，DNA链发生解链，连接在一起的金纳米粒子由于静电作用重新分散于溶液中，溶液颜色相应发生改变，从而实现食品中OTA的快速灵敏检测。　　1 实验部分　　 仪器和试剂　　UV-2450紫外可见分光光度计；XS105DU型电子天平；Milli-Q纯水机。　　氯金酸为分析级，购自于美国Sigma公司；赭曲霉毒素A购自于美国Romer公司；甲醇；其余试剂均为分析纯，实验用水是超纯水。　　包含核酸适体的DNA寡聚核苷酸和两条与之部分互补的DNA寡聚核苷酸均由生工生物工程股份有限公司合成，其序列如下：　　连接链：5’-ACTCATCTGTGAAGA？GATCGGGTGTGGGTGGCG TAAAGGGAGCATCGGACA -3’；5’端巯基化DNA：5’-HS-CACCCGATCTCT-3’；3’端巯基化DNA：5’-TCACAGATGAGTA10-SH-3’；使用前3种DNA链分别用水溶解，配制成100μM的溶液。　　 金纳米粒子的制备　　利用柠檬酸钠还原法合成实验用的金纳米粒子。具体方法如下：将100mL新鲜配制的1mM的HAuCl4溶液加入到锥形瓶中，于恒温电磁搅拌器上加热沸腾2min，然后迅速加入2mL质量分数为5%的柠檬酸钠溶液，继续搅拌，加热保持沸腾10min，使溶液的颜色由淡黄色变为酒红色，停止加热，搅拌使其冷却至室温，然后将制备的纳米金溶液装入棕色试剂瓶中，置于4℃冰箱中保存备用。　　 核酸适配体-金?{米粒子探针的制备　　取5’端巯基化DNA以及3’端巯基化DNA的溶液各100μL加入10mL纳米金溶液中，搅拌均匀后，在室温下放置12h，使DNA链通过Au-S键结合到纳米金表面，再加入100μL的包含核酸适配体连接链溶液，混合均匀后，将溶液加热至94℃ 2min，快速冷却至30℃，保持30min，使包含核酸适配体连接链与纳米金表面结合的DNA杂交。然后在16000rpm下离心15min，以去除多余的、没有和纳米金结合的DNA链，加水清洗后再次离心，将制备的核酸适配体-金纳米粒子探针用10mL浓度为20mM pH=的磷酸盐缓冲溶液分散，4℃冰箱保存备用。　　 核酸适配体-金纳米粒子比色探针对OTA的检测　　OTA标准溶液：用甲醇将OTA溶解配制成1mM的标准储备溶液，临用前用PBS稀释成不同浓度的测试液。　　实