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基于抗原决定基的胰岛素分子印迹电化学传感器 　　摘要采用抗原决定基法制备了胰岛素电化学分子印迹传感器。以胰岛素C端多肽作为模板分子，定向自组装在Au电极上，以邻苯二胺为功能单体，电化学聚合制备分子印迹聚合膜。以NaOH为洗脱液，洗脱模板分子，形成的与胰岛素C端多肽三维结构相匹配的分子印迹孔穴能特异性识别胰岛素。重吸附胰岛素分子后，以K3[Fe6]/K4[Fe6]为探针，通过测量探针在电极表面产生的电流大小实现胰岛素的间接测定。在 × 10　　Symbolm@@ 14～ × 10　　Symbolm@@ 13 mol/L浓度范围内，传感器的电流响应值与胰岛素浓度呈良好的线性关系，检出限为 × 10　　Symbolm@@ 15 mol/L。此传感器具有较好的选择性和稳定性，并成功用于血清样品中胰岛素的测定。　　关键词胰岛素； 分子印迹； 电化学传感器； 抗原决定基法　　1引 言　　胰岛素是一种对体内碳水化合物和脂肪代谢调节至关重要的激素[1]，对促进人体合成糖原、脂肪和蛋白质，以及人体细胞的生长发育和人体健康具有重要的意义。目前， 检测胰岛素的方法主要有酶联免疫分析法[2]、发光免疫分析法[3]、放射免疫分析法[4]和高效液相色谱法[5，6]等。这些方法存在易受干扰、测试条件苛刻、仪器昂贵等缺点。因此，建立特异性识别胰岛素的简便、快速的分析方法具有重要意义。　　分子印迹传感器因其具有良好的特异性识别能力和操作简单等优点而迅速发展[7]，并在蛋白质等大分子检测领域中得到广泛的运用[8～10]。Prasad等[11]以胰岛素为模板分子，以磷脂酰胆碱脂作为功能单体通过自由基聚合在多壁碳纳米管表面制备分子印迹聚合物修饰电极，利用胰岛素含有的酪氨酸残基在产生不可逆氧化峰对胰岛素进行测定。由于胰岛素的构象多样性，空间位阻效应大，导致该法模板分子不易洗脱；胰岛素电活性差，直接测量氧化电流灵敏度较低，且氧化电位过高，样品中共存还原性物质易产生干扰。　　抗原决定基法[12～14]是近年发展起来的一种蛋白质印迹新方法，该法以蛋白质表面的特征多肽作为模板分子制备分子印迹聚合物，以形成的三维孔穴特异地识别多肽，进而对蛋白质分子进行识别[15，16]，避免了整体印迹法模板分子不易洗脱等缺点。但用抗原决定基法构建胰岛素分子印迹传感器尚未见报导。本研究将半胱氨酸修饰的胰岛素C端多肽定向自组装在Au电极表面，作为模板分子，以邻苯二胺作为功能单体，采用电化学聚合的方法制得胰岛素C端多肽分子印迹膜；洗脱后的分子印迹膜上形成能特异性识别该段多肽的孔穴，进而识别整个胰岛素分子。通过测量K3[Fe6]/K4[Fe6]探针在电极上产生的氧化还原电流，实现胰岛素含量的间接测定。　　2实验部分　　仪器与试剂　　CHI660D电化学工作站；AL204型电子分析天平；KQ3200DE数控超声波清洗器； PHS3D数显酸度计；采用三电极系统：工作电极为Au电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。　　邻苯二胺、甲醇；K3Fe6、K4Fe6、Na2HPO4?12H2O、NaH2PO4?2H2O等试剂；半胱氨酸修饰的胰岛素C端多肽；胰岛素。若无特殊说明，实验所用试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。　　胰岛素C端多肽溶液的配制：以 mol/L PBS?冲溶液配制 × 10　　Symbolm@@ 4 mol/L胰岛素C端多肽溶液，4℃保存，待用。邻苯二胺溶液的配制： 以 mol/L PBS溶液配制5 mmol/L邻苯二胺溶液。　　实验方法　　自组装胰岛素C端多肽移取适量胰岛素C端　　多肽溶液于 mL离心管中，将抛光后的Au电极浸入胰岛素C端多肽溶液中1 h，利用AuS键进行自组装，以K3[Fe6]/K4[Fe6]溶液为探针，通过差分脉冲伏安法、循环伏安法和交流阻抗法对自组装后的修饰电极进行表征。　　传感器的制备将配制好的邻苯二胺溶液转移至15 mL烧杯中，　　以自组装胰岛素C端多肽后的Au电极为工作电极， 通过循环伏安法进行电聚合，电位为0～ V，扫描速度为50 mV/s，扫描圈数为10 圈，形成分子印迹聚合物。以2 mol/L NaOH溶液为洗脱液，将聚膜后的修饰电极在磁力搅拌下进行洗脱，洗脱时间为35 min，将模板分子洗脱后，得到分子印迹传感器。非分子印迹聚合膜的制备不需要在Au电极上自组装胰岛素C端多肽，其它步骤与分子印迹膜制备相同。制备过程如图1所示。　　3结果与讨论　　分子印迹膜的制备　　以 mol/L PBS 缓冲溶液为溶剂，配制5 mmol/L邻苯二胺溶液，以循环伏安法进行电聚合，聚合电位为0～+ V，扫描速度为50 mV/s。结果如图2所示，随着扫描圈数的增加，电流逐渐减小并趋于稳定，说明邻苯二胺已成功聚合在Au电