第七章重组子的筛选与鉴定.ppt

（2）DNase I足迹试验 试验原理： 蛋白结合在DNA片段上，保护结合部位不被DNase破坏，这样，蛋白质在DNA片段上留下了“足迹”，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。 待测双链DNA分子用32P末端标记，并去掉一个末端。 与细胞蛋白提取物结合，加入少量DNase I消化DNA分子。控制酶的用量，达到每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键断裂，同时设未加蛋白质的对照。 专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 五、DNA-蛋白质相互作用筛选法 一般克隆与筛选策略 六、植物转化体报道基因筛选法 （1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （β-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。 1. 报道基因（reporter gene) （4）其它 2. 几种报道基因的作用原理 4-甲-β-D-葡糖醛酸 荧光产物 GUS GFP 紫外光照 发绿色荧光 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸 蓝色水解产物 GUS Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP 转入萤火虫的luciferase的烟草 GFP- Kac的狗 GFP 老鼠 GFP Alba 发青绿光芒的兔子 GFP 鱼 烟草叶片表达B型肝炎抗原 植物细胞中适用的报道基因 酶活性 是否显性 方法是否成熟 新霉素磷酸转移酶 显性 成熟 潮霉素磷酸转移酶 显性 成熟 二氢叶酸还原酶 显性 成熟 氯霉素乙酰基转移酶 显性 成熟 庆大霉素乙酰基转移酶 显性 成熟 胭脂碱合成酶 隐性 成熟 章鱼碱合成酶 隐性 成熟 β-D-葡萄糖苷酶 隐性 成熟 链霉素磷酸转移酶 显性 成熟 萤火虫荧光素酶 隐性 成熟 细菌荧光素酶 隐性 成熟 苏氨酸脱氢酶 显性 成熟 磷酸肌醇乙酰转移酶 显性 成熟 乙酰乳酸合酶 显性 不成熟 绿色荧光蛋白 显性 成熟 Bromoxynil 硝化酶 显性 不成熟 5-enolpyruvylshikimate-3磷酸转移酶 显性 成熟 * Higher protein peanuts Longer shelf life for bananas and pineapples Sweeter bell peppers Tastier tomatoes Lower fat vegetable oils 5. Western 印迹杂交（Western blotting ） Western杂交也与Southern杂交相似，只不过在Blotting过程中转移的是蛋白质而不是 DNA，这种将蛋白质样品从 SDS凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法，称为Western blotting。 其后的杂交过程不是真实意义的分子杂交，而是通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的探针不是DNA或RNA， 而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。 Western blotting 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。 ① Western（转膜） 胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。 膜 胶 蛋白 Western装置 ② Blotting 原理与ELISA相同。 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗 辣根过氧 化物酶 底物 产物， 并发出光 PAGE胶 待测蛋白 底片曝光 辣根过氧化物酶：HRPO 1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。 2）洗去未结合的一抗。 3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。 ③ Blotting过程 Immuno Blotting ④结果 多克隆抗体Blotting的结果 单抗blotting结果 方法 优点 弱点 选择顺序 1.α-互补 简洁而行 试剂贵,受材料限制 有钱首选 2.质粒快提定酶切鉴 方便易行 费时费力 无钱首选 3.插入失活 易行 受材料局限 可选 4.杂交 经典灵敏 放标/非放标 可选 4种方法选择: 四 免疫化学检测法及其它 直接的免疫化学检测技术，同菌落杂交技术在程度上是十分类似的。它是用抗体鉴定那引起产生外源D