基因工程制药培训(ppt 79页).pptVIP

目的产物在初始物料中的含量较低； 含目的产物的初始物料组成复杂，除目的产物外，还有大量的细胞、代谢物、残留培养基、无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大； 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易失活、变性； 种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构和性质复杂又各异的生物活性物质； 应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原。 基因工程药物或生物技术产品特点 一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素 1. 含目的产物的初始物料的特点 （1）菌种类型及其代谢特性 （2）原材料和培养基的来源及质量是否稳定 （3）生产工艺和条件 （4）初始物料的物理、化学和生物学特性 2. 物料中杂质的种类和性质 3. 目的产物特性 4. 产品质量的要求 二、分离纯化的基本过程 基因工程药物的分离纯化主要分为5个步骤， 包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度 纯化直至得到纯品，以及成品加工。 （二）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因的剂量 外源基因的表达效率： A、启动子的强弱：将目的基因插入大肠杆菌RNA聚合酶能识别的强启动子下游 B、核糖体结合位点的有效性 C、SD序列和起始密码的间距 D、密码子组成：设计引物或合成基因时选择大肠杆菌“偏爱”的密码子 表达产物的稳定性： A、组建融合蛋白； B、利用信号肽将真核基因产物搬至周质空隙中； C、位点特异性突变，增加蛋白的稳定性； D、采用蛋白酶缺陷型大肠杆菌，减弱降解作用 细胞的代谢负荷： A、宿主细胞的生长与外源基因的表达分开； B、宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开； C、形成不溶性的包涵体 工程菌的培养条件 （三）真核基因在大肠杆菌中表达的形式 1.以融合蛋白的形式表达药物基因 其氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，以原核多肽和真核蛋白结合在一起，称融合蛋白。 优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，不易被 细菌酶类降解；易实现高效表达； 缺点：有免疫原性，需切除原核多肽 2.以非融合蛋白的形式表达药物基因 非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 优点：保持原有蛋白活性； 缺点：易被蛋白酶破坏；可能引起人体免疫反应 3.分泌型表达蛋白药物基因 将外源基因融合到编码信号肽序列的下游。 常用的信号肽有：碱性磷酸酶信号肽；膜外周质蛋白 信号肽；霍乱弧菌毒素B亚单位； 优点：在周质中稳定，有活性，不含甲硫氨酸残基； 缺点：产量不高，信号肽不被切割或不在特定位置上切割。 酵母中的基因表达 （一）表达载体 1.载体的复制序列 （1）YEp类（酵母附加体质粒） （2）YRp类（酵母复制型质粒） （3）YCp类（酵母着丝粒质粒） （4）YIp类（酵母整合型质粒） 2. 克隆载体 向酵母载体中引入大肠杆菌质粒pBR322的ori部 分和Ampr或Tetr部分，这样构成的克隆载体同时带 有细菌和酵母的复制原点和选择标记。 酵母常用的选择性标记：氨基酸或核苷酸合成酶 系基因，对抑制酵母生长的药物具有抵抗力的抗性 基因 3.表达载体 普通表达载体：只能方便地引入外源基因并进行表 达，对表达产物的组成，特别是对其N末端氨基酸 是否增减并无严格要求。 精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列的 适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并 使它在表达和加工后N末端氨基酸序列与天然产物 相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。 （二）影响目的基因在酵母菌中表达的因素 1.外源基因的剂量：质粒拷贝数及其在宿主细胞内的稳定性 2.外源基因的表达效率： A、启动子 B、分泌信号的效率 C、终止序列的影响 3.外源蛋白的糖基化 4.宿主菌株的影响： A、菌体生长力强； B、菌体内源蛋白酶要弱； C、菌株性能稳定； D、分泌能力强 基因工程菌的培养 基因工程菌发酵的基本操作方式有： 分批培养 分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限 半连续培养（补料分批） 在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的 生长，或得到更多的代谢产物 连续培养 不断地流加营养，并不断地取出发酵液。连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。