基因组编辑技术.ppt

类别 ZFN TALEN CRISPR /Cas9 NgAgo-gDNA 构成 ZF Array∷Fok1 TALEN Array∷Fok1 Cas9∷sgRNA NgAgo-gDNA 靶向元件 ZF Array蛋白 TALENArray蛋白 sgRNA核糖核苷酸 gDNA脱氧核糖核苷酸 切割元件 Fok Ι蛋白 Fok Ι蛋白 Cas9蛋白 Ago蛋白 优势 单位点编辑 单位点编辑 多位点编辑 多位点编辑 靶向序列 18bp 30bp 23bp 20bp 切割类型 双链断裂，单列缺刻 双链断裂，单列缺刻 双链断裂，单列缺刻 双链断裂，单列缺刻 技术难度 困难 较容易 非常容易 非常容易 商业价格 ~60000每位点 ~10000每位点 ~1000每位点 ？ 脱靶效应 较轻 较轻 较严重 较轻？ 编辑技术对比 NgAgo-gDNA编辑 NgAgo-gDNA是格式嗜盐杆菌（Natronobactricum grogoryi) ACO蛋白（Argonauto）的简称，其本质是一种核酸内切酶，NgAgo根据指导DNA的定位，可以有效地对基因组目标区域进行编辑。 NgAgo-gDNA 概述 NgAgo 是格氏嗜盐碱 杆 菌 （ Natronobacterium gregoryi ） AGO 蛋 白 （ Argonaute ） 的 简 称 ， 其 本 质 是 一 种 核 酸 内 切 酶 。 NgAgo 酶根据指导 DNA 的定位 ， 可以有效地对基因 组目标区域进行编辑 。 NgAgo-gDNA 与 Crispr-Cas9 特点比较 NgAgo-gDNA Crispr-CAS9 5-P-ssDNA 介导 sgRNA 介导 ssDNA无特殊二级结构要求，除靶序列一致的碱基无需其它碱基参与 sgRNA由tracrRNA和crRNA组成，需求固定的二级结构 结合靶序列23-25bp 结合靶序列19-21bp 无需PAM区 需要PAM区 NgAgo蛋白 由887个氨基酸组成 CAS9蛋白 由1368个氨基酸组成 可在哺乳动物细胞水平进行基因组编辑 可在哺乳动物细胞水平进行基因组编辑 NgAgo-gDNA 的优势 1. 设计更加灵活 由于NgAgo-gDNA系统无PAM要求，5p ssDNA设计相较sgRNA更加灵活 2. 理论上精确性会比Crispr-CAS9 高 NgAgo-gDNA识别靶序列的长度会比Crispr-Cas9长约4个碱基，另外DNA-DNA duplex的特异性比RNA-DNA duplex高,所以理论上精确性会更加高。 3. 对向导序列-靶序列错配容忍度低 脱靶率低 5. 针对富含GC的靶序列，NgAgo系统比Cas9系统切割效率更高 基因功能研究 基因治疗 构建模式动物 改造和培育新品种 基因编辑新技术的用途 1. 基因功能研究 基因敲除是在活体动物上验证基因功能必不可少的逻辑环节， 但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、 ES 细胞筛选、 嵌合体动物模型选育等一系列步骤， 成功率受到多方面因素的限制。 基因编辑新技术则不然， 敲除基因高效快速， 是研究基因功能的有力工具 ZFN 技术已在大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、拟南芥、玉米、烟草 等模式生物或经济物种的细胞或胚胎中以及包括诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)在内的人体外培养细胞系中成功地实现了内源基因的定点突变，其中在果蝇、 斑马鱼、大鼠等物种中还获得了可以稳定遗传的突变体。 2. 基因治疗 传统的基因治疗是将正常的基因片段引入细胞中替代有缺陷的基因， 但这种方法难以精准控制， 可能产生很大的毒副作用。基因编辑新技术可以精确定位， 在靶位点进行修正或进行基因切除， 达到基因治疗的目的。 Bacman 等人利用 TALEN 技术清除了来自于病人线粒体内的有病 DNA。这是 TALEN 首次应用于线粒体基因的编辑，这项研究有望用于治疗母系遗传的线粒体病。 Li 等人利用 ZFN 技术能在染色体上精确定位的优势， 通过 “剪切” 和 “粘贴” 基因， 在实验小鼠体内实现了血友病治疗， 避免了传统基因疗法带来的插入诱变风险， 首次取得了基因组编辑在基因疗法上的突破。 3. 构建模式动物 基因编辑新技术不受 ES 细胞的限制，效率高，速度快，且定点编辑更加精确，可在多种细胞及生物体的特定位点进行切割和修饰。构建转基因小鼠第一人 Jaenisch 与其同事最近利用 CRISPR- Cas 系统又构建了携带特异性突变的小鼠模型。 4. 改造和培育新品种