人促血液血管细胞生成素对内皮细胞增殖功能的影响及其机制的分析内科学科研型专业论文.docxVIP

北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文课题一 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 课题一 人促血液血管细胞生成素(Hemangiopoietin，HAPO)对脐 静脉内皮细胞的生物学作用和信号转导机制研究 摘要 目的：人促血液血管细胞生成素(Heman百opoietin，HAPO)，是我们实验室从再 生障碍性贫血病人尿中纯化出的一种蛋白质，基因序列比较发现它是一种新的细 胞因子。HAPO基因的同源性分析(BLAST)结果表明，该因子是蛋白多糖4基 因的一种新的剪接体。功能研究发现，HAPO在体外能明显刺激入的造血及骨髓 细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖，而且HAPO主要作用于人的造血 和血管内皮干／祖细胞的早期阶段，是一种早期生长因子；HAPO还可以拮抗人巨核 细胞白血病细胞系M07e去除因子诱发的凋亡；体内研究发现HAPO有放射保护 作用，能明显提高经同位素亚致死量照射小鼠存活率，加速其造血功能的恢复。为 了能更加深入的了解HAPO的生物学功能，我们以HUVEC为实验模型，研究了 HAPO促进细胞增殖所涉及的信号转导机制。 方法：在本实验里，我们用MTT和Brdu掺入的方法检测了HAPO对于HUVEC 增殖能力的影响，并用流氏检测了HUVEC细胞周期的分布。我们用Westernblot 的方法检测了HAPO对于HUVEC内不周信号转导通路的激活情况。信号转导常 用阻断方法来进行分析。激酶抑制剂是一种小分子化合物，近年来出现的一些高 特异性蟹白激酶抑制物能够专一高效地抑制特定蛋白激酶的功能。目前，在国内 外研究信号转导机制的文献中，几乎绝大部分都采用了激酶抑制剂作为阻断分析 研究的首选。该方法特异，简单，易于量化，重复性好，且对细胞影响较少。此 外，我们对HAPO与其他作用比较明显的内皮细胞刺激因子的协同作用进行了检 测。 结果：HAPO能增加内皮细胞的增殖能力，并呈剂量依赖性。500 ng／ml HAPO的 效果最为明显，可以达到130±5％(MTT)和142±6％(BrdU)。通过Western blot分析，我们发现HAPO在HUVEC中激活了P13．FdAkt信号通路，50 gM的 4 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文LY294002可以完全抑制HAPO造成的Akt的磷酸化。我们用抑制剂阻断的方法 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 LY294002可以完全抑制HAPO造成的Akt的磷酸化。我们用抑制剂阻断的方法 证明了HAPO是通过激活P13一K／Akt信号通路来促进HUVEC增殖的。进一步的 检测与分析发现HAPO可以明显的上调HUVEC中cyclin D1蛋白的表达。在协 同作用分析中，HAPO可以明显的增加VEGF的促内皮增殖的能力，却没有能增 加bFGF促内皮增殖的能力。 结论：我们的研究表明HAPO具有促进内皮细胞增殖的生物学作用。HAPO通过 激活内皮细胞中的P13．K／Akt信号通路，进而上调cyclin D1蛋白的表达。这可能 是HAPO促进内皮细胞增殖的信号转导机制之一。 [关键词]HAP0，细胞增殖，PI一3K／Akt，cyclin D1，HUVEC，信号转导途径 AbstractObjectives：Hemangiopoietin(HAPO)is Abstract Objectives：Hemangiopoietin(HAPO)is a novel growth factor,originally identified and purified from the urine of patients with aplastic anemia．Previously,we have demonstrated that human recombinant HAPO(rhHAPO)，which has been produced based on the N—terminal amino acid sequence of purified native HAPO，supports survival and proliferation of primitive cells of both hematopoietic and endothelial cell lineages，and efficiently protects mice from radiation damage．Recently,we have reported that rhHAPO protects M07e ceils from apoptosis by inactivating caspase 3 and blocking the PARP degradation thr