prrsvnsp1α单克隆抗体制备及蛋白质组学研究预防兽医学专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士学位论文3．2．15重组慢病毒的验证 华中农业大学2016届硕士学位论文 3．2．15重组慢病毒的验证 ．26 3．2．16用于蛋白质组学分析的细胞样品的制备 ．26 3．2．17全细胞蛋白质的提取 ．26 3．2．1 8蛋白质的酶解 ．27 3．2．19 iTRAQ 4 plex试剂标记肽段 。27 3．2．20 SCX分离 ．27 3．2．21基于Triple TOF 5600的LC—MSMS分析 28 3．2．22生物信息学分析 ．28 3．2．23 Western Blot验证蛋白组学数据 30 第4章结果与分析 ．31 4．1 PRRSV nspla的表达与纯化 ．．3l 4．2 PRRSV nspla单克隆抗体的制备与验证 ．．31 4．2．1 PRRSV nspla单克隆抗体的制备 3l 4．2．2 IFA验证PRRSV nspla单抗 32 4．2．3 Western Blot验证PRRSV nspla杂交瘤细胞上清 ．32 4．2．4 PRRSV nspla小鼠腹水的制备与验证 33 4．3 PRRSV nspla单克隆抗体的亚型鉴定 。34 4．4 PRRSV nspla重组慢病毒的制备与验证 。35 4．4．1 PRRSV nspl a重组慢病毒的包装 35 4．4．2 PRRSV nspla重组慢病毒的验证 36 4．5 PRRSV nspla蛋白质组学数据的分析与验证 。36 4．5．1差异蛋白的亚细胞定位 37 4．5．2差异蛋白的功能聚类 38 4．5．3差异蛋白的网络互作图 40 4．5．4 Western Blot验证蛋白组学数据 。41 第5章分析与讨论 ．43 5．1讨论 ．43 5．1．1 iTRAQ蛋白组学技术的优缺点 43 5．1．2基因复制相关蛋白 43 5．1．3凋亡相关蛋白 44 5．1．4炎症相关蛋白 45 5．2结论 ．46 参考文献 47 I咐 表 56 致 谢 66 II 万方数据 PRRSV PRRSV nspla单克隆抗体制备及蛋白质组学研究 摘要 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的重要病原之一，它能 干扰宿主I型干扰素(IFN)的表达及I型IFN介导的信号通路，从而抑制感染猪的 免疫反应。PRRSV基因组编码的非结构蛋白la(nsplct)能抑制I型IFN的产生，在 PRRSV感染宿主细胞后的免疫反应中发挥着重要的作用。另外，nspla在PRRSV 亚基因组的合成中也扮演着重要的角色，但具体机制尚不明确。本研究制备了 PRRSV nspla的单克隆抗体，并将nspla基因连接于慢病毒载体，然后在猪肺泡巨 噬细胞传代细胞系(PAM一3D4)中表达。提取宿主细胞的全蛋白后采用iTRAQ技术 进行蛋白质组定量分析，共鉴定到1．2倍以上差异蛋白299个。此外，本文还探讨 了PRRSV编码的nspla在调控宿主天然免疫反应中发挥的作用。主要研究如下： I．PRRSV nspla蛋白的原核表达与纯化 将PRRSV WuH3株的nspla基因插入原核表达载体pET-28a中，构建了原核表 达质粒pET-28a-nspla，将其转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后经SDS—PAGE检测证 实nspla蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，并主要以不溶性包涵体形式存在。对包 涵体进行纯化后得到浓度为0．64 mg／rnL的nspla蛋白。 2．PRRSV nspla单克隆抗体的制备及亚型分析 用纯化的nspla原核蛋白免疫BALB／c小鼠，取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合， 经ELISA筛选和3次克隆后共得到11株可持续分泌抗nspla抗体的细胞株，分别 命名为lA7、1A10、1C3、2D3、2E5、2E7、389、3E4、3E11、3G2、4E5。经间接 免疫荧光(IFA)和Western Blot检测证实其中7株(2E5、2E7、389、3E4、3Ell、 3G2、4E5)与nspla具有良好的特异性反应。亚型检测发现这7株单抗的轻链均为 kappa链，其中6株单抗(2E5、2E7、389、3E4、3Ell、4E5)的重链为IgGl型， 只有3G2株单抗的重链为IgG2a型。 3．表达PRRSV nspla慢病毒的包装及验证 为了研究nspla对PAN[．3D4细胞蛋白表达的影响，将包含nspla的表达质粒与 慢病毒包装辅助质粒共转染HEK-293T细胞，在转染后24 h和48 h分别收集细胞上 清，用Western Blot和IFA进行验证，结果都能检测到目的基因的表达，并且确定 了目的基因表达的最佳时间点为感染后72 h。 4．PRRSV nspla蛋白质组学数据的分析 将表达nspla的慢病毒感染PAM．3D4细胞，72 h后收