假蕈状芽孢杆菌34kd纤溶酶基因的克隆与表达生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要 摘要 本论文重点研究了假蕈状芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)34 kD纤溶酶基因 的克隆及在大肠杆菌中的表达，并做了一些枯草杆菌表达方面的研究。主要研究结果 如下： 本实验室顾从土壤中分离筛选出具有纤溶酶活性的假蕈状芽孢杆菌，且对此菌株 的纤溶酶蛋白进行分离纯化，得到34 kD单一活性组分，埃德曼降解法测得N端序 歹0为VTGTNAVGTGKGVLG。 根据此十五个氨基酸在NCBI上进行比对，找到了十种100％同源蛋白序列，并 根据相对应的编码序列的同源性设计了一对简并引物，并在5’端分别加入了EcoRI 和XhoI的酶切位点。以产纤溶酶的菌株假蕈状芽孢杆菌的基因组DNA为模板，利用 设计的引物进行PCR，获得了一个完整的两头含酶切位点的纤溶酶基因BpFE。 使用砌RI和励DI双酶切载体pGEX．4T-2和BpFE基因，通过连接构建了重组 质粒pGEX．BpFE，并对BpFE基因进行了测序。结果表明：此细菌纤溶酶基因全长 1701 bp，编码566个氨基酸。与相似性最高的序列bacillolysin(Bacillus cereus H3081．97)比仅存在5个氨基酸的差异，含有中性锌金属蛋白酶结构域。 将重组质粒pGEX．BpFE利用热激转化法转化到大肠杆菌宿主菌BL21中，经 IPTG、低温诱导后，SDS．PAGE显示胞内含有表达条带，表达产物的相对分子量大 小为98 kD，比预计的分子量(90 kD)稍大。酪蛋白平板法和纤维蛋白板法均显示 1．0 mmoVLIPTG，26℃和30℃诱导5小时后的重组菌经超声波破壁后的胞内蛋白有 活性。 但是大肠杆菌表达系统大部分为胞内表达，这样就为生产带来了很多的不便。而 枯草芽孢杆菌由于其安全性和分泌胞外蛋白的特点，被认为是表达和分泌异源蛋白的 理想受体。 以pUCl9．5．2为模板，通过PCR方法得到含sacB基因的启动子、200bp的类似 转录终止信号的序列、核糖体结合位点及编码29个氨基酸的信号序列，将此535bp 序列通过酶切连接到大肠．枯草穿梭质粒pMK4上，构建了大肠杆菌．枯草芽孢杆菌诱 导分泌型穿梭质粒pSK4。并将纤溶酶基因BpFE克隆到了pSK4载体上，待下一步 进行枯草杆菌的分泌表达研究。 本试验试图建立用基因工程的方法生产微生物纤溶酶的技术平台，以便进一步研 究纤溶酶的功能、作用机理及在生命科学、医疗和保健等方面的应用潜力，为基因工 程药物的开发奠定必要的理论和实践基础。 关键词：假蕈状芽孢杆菌；纤溶酶；大肠杆菌；枯草杆菌；克隆；表达 Cloning Cloning and Expression of 34KD Fibrinolytic Enzyme Genes frompseudomycoides Master candidate：Guoxiao-jun Major：Biochemistry and molecular biology Supervisor：Zhubao-cheng Abstract We mainly studied the cloning of fibrinolytic enzyme genes produced by microorganism and its expression in E．coli and Bacillus subtilis．The results are as follows： Gu screened Bacillus pseudomycoides with fibrinolytie enzyme activity from soil， then separated and purified a 34 kD protein．Edman degradation showed that 1 5 amino acids of N-terminal sequence were VTGTNAVGTGKGVLG By using the program of BLAST on NCBI GenBank database，we found ten protein sequences with 1 00％homology．Then degenerate primers were designed based on the homology of coding sequence．We also added EcoRI and XhoI restriction site on both ends． Using genomic DNA ofB．pseudomycoides as template，we proformed PCR and obtained a complete fibrinolytic e