DNA的分离、提取和纯化技术-WL.pptVIP

DNA的分离、提取和纯化技术 营养与食品卫生学专业 王 亮 DNA的理化性质及特点 一 物理性质 1、形态 DNA为白色纤维状固体（通常溶于TE缓冲液或水）。 2、溶解性 溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；DNA在水中呈粘性胶体溶液。在酸性溶液中DNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 核酸既含有酸性的基团，又含有弱碱性的基团，故可发生两性解离。其解离状态随溶液的pH值而改变。 3、两性解离 利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的等电点来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。 嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。在紫外区260nm和280nm处有强的吸收峰 。在260nm紫外线下，1OD（光密度值）相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为40μg/ml。因此可根据核酸溶液的OD值，计算核酸样品的浓度或含量。对于纯的DNA，可以通过A260/ A280值来判断其纯度。 纯的DNA：A260/ A280 =1.8 二 紫外吸收性质 DNA的特点 （1）DNA（或RNA）是水溶性的。 （2）嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系 （3）从核酸的分子结构上看，核酸是两性电离，既带正电荷， 又带负电荷。 （4）DNA在细胞中存在部位不同（细胞核、线粒体、质粒）。 （5）DNA空间构象不同，电泳时迁移率不同。 （6）根据碱基互补配对原则，可设计引物和探针。 （7）DNA的双螺旋结构。 DNA提取的方案：应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，基因组DNA的提取方法也有差异。 在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。 DNA的提取方案 DNA提取、纯化的方法 （1）酚抽提法 （2）甲酰胺解聚法 （3）玻璃棒缠绕法 （4）异丙醇沉淀法 （5）以及适用于小样品量DNA提取的试剂盒等 大多数核酸提取与纯化的方法包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。不同的方法之间主要是步骤与技术的差异，原理基本一致。 最经典的 最常用 试剂盒提取DNA 实验原理： 试剂盒提取DNA的基本原理是用细胞裂解液CL、缓冲液FG和蛋白酶K，破坏、消化细胞，用异丙醇和乙醇沉淀DNA，最后收获DNA。 试剂盒提取DNA的基本步骤 细胞破碎、裂解细胞 核酸与其他大分子物质分离 核酸纯化 酶处理 所用器械与设备 1.磷酸盐缓冲液（PBS）：用于漂洗样本 2.细胞裂解液CL：裂解细胞、破坏细胞 3.蛋白酶K与缓冲液FG：消化细胞、缓冲溶液pH值、抑制DNA聚 合酶活性、破坏降解RNA 4.异丙醇：沉淀DNA 5.70%乙醇：漂洗DNA 6.缓冲液TE：溶解DNA 试剂及其作用 样品前处理 (1)从低温冰箱中取出事先采集好的血样 (2)将血细胞放入研磨器中研磨。 (3)加入PBS缓冲液，将样本转移13ml离心管中，5400rpm， 20min，4度离心，弃上清。 (4)用1mlPBS将离心沉淀物转移至1.5mlEP管中，5400rpm，3min，4度离心，弃上清。 （1）若不能马上进行DNA提取，可将样本封存贮存于－20℃冰箱 中。 （2）研磨均匀，没有团块 （3）离心时注意配平 注意事项 DNA提取步骤 1．消化 向上述处理好的样品溶液中，加入细胞裂解液CL，颠倒混匀数次（目的：细胞破裂，使蛋白、核酸释放）。12000rpm，1min，弃上清。将离心管倒置在吸水纸上。 2．缓冲液FG与蛋白酶K 向样品中加入缓冲液FG与蛋白酶K的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块，混匀非常重要，充分的混匀有利于将蛋白质等大分子物质与蛋白酶K接触。 3．水浴 65度水浴10min，其间颠倒数次。 4．加入异丙醇 颠倒充分混匀至出现丝状或簇状DNA。 12000rpm，5min，弃上清。倒置在吸水纸上。 5．加入70%乙醇，涡旋振荡5秒钟，12000rpm，2min， 弃上清。重复操作两次。倒置在吸水纸上，至少5min。空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净（至少5min） 6. 加入缓冲液TE，低速涡旋5s，65度加热10min-1h， 溶解DNA，其间弹数次助溶 残液 大分子物质 混合液 混合液 细胞裂解液CL 混合液 离心、弃上清 缓冲液FG与蛋白酶K 沉淀生成 异丙醇 DNA 70%乙醇 缓冲液TE 7.样品测定