升麻中环菠萝蜜烷型三萜化合物抗肿瘤活性及作用机制研究生药学专业论文.docxVIP

北京协和医学院 北京协和医学院 硕士研究生毕业论文 摘要 传统中药升麻(Cimicifuga foetida L．)中含有大量环菠萝蜜烷型三萜类 成分，研究表明该种植物来源的环菠萝蜜烷型三萜类化合物在体内外对多种 肿瘤细胞均具有增殖抑制作用。然而前人的研究多集中在对该类化合物的分 离和结构鉴定上，本论文旨在对从升麻中分离的此类化合物SM306及SM308 开展抗肿瘤机制研究。主要研究结果如下： 1．化合物SM306抑制乳腺癌细胞MCF一7细胞的增殖活性及机制研究。MTT实 验及克隆形成实验结果表明M306对MCF一7细胞具有显著的增殖抑制作用， PI染色分析发现SM306能够诱导MCF．7细胞周期阻滞于G2／M期，进一步 检测发现蛋白cyclin B1和p-CDKI(Thrl61)水平下调可能参与SM306诱导的 细胞周期阻滞。Hoechst 33258染色观察及PFAnnexin V双染分析表明SM306 可以诱导MCF．7细胞发生凋亡。进一步研究发现SM306作用细胞后，细胞 线粒体膜电位降低、Caspase 9及PARP被剪切活化，促凋亡蛋白Bax水平 上调而抗凋亡蛋白Bcl．2水平下调，同时磷酸化的Akt(Ser473和Thr308) 被抑制，提示SM306经线粒体途径诱导MCF．7细胞凋亡。进一步Western blotting检测表明，p-ERKl／2及上游主要调控蛋白P—C．Raf水平均发生下调， 提示Raf／MEK／ERK信号通路参与SM306诱导的MCF一7细胞凋亡。 2．化合物SM308诱导肝癌耐药细胞HepG2／ADM细胞自噬流损伤和凋亡的机 制研究。首先MTT实验表明该化合物对HepG2／ADM细胞显示出较好的增 殖抑制活性，并且饥饿处理可以显著提高其对细胞的增殖抑制作用。采用 MDC染色观察酸性囊泡，Western blotting检测自噬相关蛋白如LC3、Beclin l，At95的含量变化，结果表明SM308处理后细胞出现了大量自噬体。进一 步采用LC3 Turnover实验对细胞自噬流进行评估，并且p62／SQSTMl蛋白作 为自噬选择性降解底物其水平增加，表明SM308抑制HepG2／ADM细胞自 噬流。采用透射电镜观察细胞亚显微结构，发现大量包裹有未能降解内容物 的单层膜结构即自噬溶酶体积累于细胞中，通过DQ．BSA实验检测发现 SM308抑制了细胞溶酶体的降解活性。更重要的是，SM308处理细胞l h后 P13激酶P110 a和p-Akt(Ser473)水平均明显上调，说明P13K／Akt信号通 路被活化。并且我们使用P13K抑制剂LY 294002或者Akt的siRNA处理细 胞时，SM308导致的LC3．II的累积量减少，同时p62／SQSTMl蛋白作为自 噬性降解底物其含量也发生降低，即抑制P13K和Akt可以减轻SM308对细 胞自噬流的抑制，表明P13K／Akt通路的的活化参与SM308对细胞自噬流的 万方数据 北京协和医学院 北京协和医学院 硕士研究生毕业论文 抑制过程中。此外，PI／Annexin V双染分析及Western blotting检测等结果表 明SM308可能通过内源性线粒体途径诱导HepG2／ADM细胞凋亡。并且与 单独使用SM308处理细胞相比，采用饥饿处理或者用Rapamycin抑制mTOR 以增强细胞自噬启动后，SM308诱导的细胞凋亡明显增强，表明SM308引 起的白噬流损伤促进细胞发生凋亡。 综上所述，本研究探讨了升麻中环菠萝蜜烷型三萜类化合物抗肿瘤作用 机制，为此类化合物作为抗癌药物的研究开发和临床应用提供理论依据。 关键词：升麻；环菠萝蜜烷型三萜类化合物；凋亡：自噬流；信号通路 万方数据 AbstractPrevious Abstract Previous chemical researches have demonstrated that Cimicifuga foetida L． contained plenty of cycloartane triterpenoids which have been proved to have growth inhibitory activities on several cancers in vivo and砌vitro．HoweveL previouS research mainly focused on isolation and structure identificatio