COS7细胞冻存和复苏传代培养.ppt

研究目的 建立CoS-7细胞培养的方法 观察COS－7细胞培养的特点 了解COS－7细胞的用途 建立CoS-7细胞培养的方法 主要阐述CoS-7细胞培养的体系 观察COS－7细胞培养的特点 是贴壁细胞还是悬浮细胞？细胞培养过程中形态的变化，分裂生长的形式等 了解COS－7细胞的用途 COS-7细胞的来源、特性及生命医学用途： 小结 二 结果 1??????? 复苏细胞：第1d,镜下观察复苏细胞悬浮于培养液中,折光性强,胞体呈圆形。第2d,复苏细胞镜下观察细胞大部分贴壁。第3d,复苏细胞镜下观察细胞增殖速度较快，折光性好。5d后可按比例传代。 三 讨论 1 养细胞维持传代以供实验用常遇到某些困难。首先，细胞株在传代中其性质发生变化。其次，在传代中有微生物污染的危险。解决这些困难的办法就是将细胞冻存。细胞冻存在液氮中，贮存时间几乎是无限的（因为在-130℃以下，所有的生化反应已停止，而液氮的温度在-150～-160℃之间） * * COS7细胞冻存和复苏传代培养 郭美琼 指导老师 陆家海 欧阳丽萍 COS7细胞(猴细胞的一种细胞系)为重组病毒的宿主细胞，是表达SV40大T抗原的非洲绿猴肾细胞株，能支持部分突变型SV40和含SV40 ori的质粒载体的复制,可高水平表达外源基因，常作为瞬时表达宿主。故本实验建立COS7细胞的冻存和复苏传代方法。 （一）实验材料 1 细胞株 cos7细胞株 2 试剂 RPMI-1640培养基?小牛血清（NBS）?N-(2-羟乙基)-哌嗪-Ng-2（丙磺顺酸）（Hepes，Sigma公司产品）胰蛋白酶?碳酸氢钠以及链霉素和青霉素 3 实验准备 1 培养液的配置 1 (1) RPMI-1640液：1640粉2袋?Hepes 2.14g?碳酸氢钠4.0g加水至2000ml调至PH=7.15，过滤。1 (2) 1640完全培养液：10％小牛血清＋双抗（含链霉素、青霉素）的1640培养液，4℃保存。1 (3) 10%DMSO冻存液的配置：1份DMSO?3份小牛血清?6份完全培养基1 (4) 胰蛋白酶1.25g?EDTA（乙二胺四乙酸二钠）0.10g?于烧杯中先用少许PBS调成糊状，再补充PBS至500ml，搅拌混匀4小时后用滤器过滤除菌，分装，低温保存。 2 Cos7细胞冻存方法2 （1） 取对数生长期的细胞，收集细胞前换液一次。2 （2） Cos7细胞培养物经胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，1200转/分离心1分钟，去上清。弹指法分散沉淀细胞后，左手摇动离心管，右手逐滴加入与细胞悬液等量的DMSO冻存液。2 （3） 分装：细胞悬液分装在2 ml 冷冻管中，密封后标记细胞名称和冷冻日期。2 （4） 梯度降温冻存：冷冻管置-20℃、停留1～2小时，再降至－70℃过夜，投入液氮。 3 Cos7细胞复苏3 （1） 将加有小牛血清＋双抗的1640完全培养液从冰箱取出，升至室温。3 （2） 从液氮中取出冻存管，迅速投入3738℃水浴中，摇晃使其在1分钟左右融化。3 （3） 转至EP管，加1640完全培养液至1.5 ml左右，吹打，1200转/min，离心3分钟。3 （4） 去上清，再加1640完全培养液至1.5 ml左右漂洗，离心3分钟。去上清，加新鲜培养液吹打重悬浮细胞，转至培养瓶中加培养液至总体积约4ml.，置温箱培养。 4 Cos7细胞传代4 （1） 弃掉培养瓶内原来的培养液，加入5～7滴，轻轻转动培养瓶，让胰蛋白酶浸匀整个瓶底，吸出胰蛋白酶。4 （2） 再加入8～10滴0.25%胰蛋白酶，将培养瓶置37℃、5％CO2孵箱2～3min，观察细胞胞体回缩变圆,细胞接近脱离瓶壁时终止消化。4 （3） 小心吸出并弃去胰酶，加入1～2ml1640完全培养液，用吸管吹打细胞，制成细胞悬液，1∶4传代。各瓶加入培养液2ml，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。 2 传代细胞：第1d,镜下观察传代细胞悬浮于培养液中,折光性强,胞体呈圆形。第2d,中,传代细胞镜下观察细胞已贴壁,折光性好,少数细胞出现伪足。第3d,传代细胞培养液镜下观察大部分细胞已伸出伪足,细胞轮廓清楚,折光性强,细胞数量明显增多。 3 传代细胞传至第6～8代仍保持增殖状态，细胞生长速度未见减慢,能长满瓶底。 2 培养细胞在瓶壁汇合后，需进行分离再培养，否则正常细胞因生存空间不足或细胞密度过大，导致营养不良而引起细胞衰老?停止生长?甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行稀释再培养，即将培养瓶内的细胞分离?稀释?接种到新培养瓶内继续扩大培养。首次传代的细胞接种数量要多些，使细胞尽快适应新环境，以利于细胞的生存和增殖，通常原代细胞按1：2分种传代，细胞株按1：4分种