理论课21第二十一章 免疫学检测原理.pptVIP

* * 第二十一章 免疫学检测原理 第一节 免疫细胞的检测 一、免疫细胞的分离和纯化 二、淋巴细胞及亚群的检测 三、免疫细胞的功能测定 第二节 免疫分子的检测 一、免疫球蛋白的测定 二、补体测定 三、细胞因子及其受体的检测 四、黏附分子的检测 第三节 免疫学检测常用的标记技术 一、免疫荧光技术 二、放射免疫测定 三、免疫酶标技术 免疫学检测技术：包括细胞、分子、相关基因三个水平 细胞水平检测：根据免疫细胞膜表面表达的独特标志及特殊 功能，测定各类细胞及其亚群数量及效应，籍以了解细胞免疫 水平 分子水平检测：测定各类Ig、补体、CK及受体、黏附分子水 平及生物学活性，籍以了解各类免疫因子间的相互关系 基因水平检测：测定免疫应答相关基因的表达与调控，免疫 分子的遗传多态性及基因型别分析 第一节 免疫细胞的检测 一、免疫细胞的分离和纯化 依据细胞独特的表面标志、理化性质及黏附吞噬能力等差异 设计不同方法，按不同实验目的、拟分离细胞的种类、纯度和数 量等，选择方法 （一）白细胞的分离 根据红、白细胞比重、沉降速度不同分离 1、自然沉降法：肝素抗凝外周血放置，红细胞沉降速度快，自 然分离 2、高分子聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮可使红细胞成钱串状凝集，加速沉降 （二）外周血单个核细胞（PBMC）的分离 PBMC包括淋巴细胞和单核细胞，人PBMC来源于外周血， 动物大、小鼠单个核细胞来源于脾脏、淋巴结（MNC）。 标本：人肝素防凝外周血；鼠脾脏、淋巴结,机械研磨?过100 目网?单个细胞悬液。 密度梯度离心法：红细胞和多核细胞密度为1. 092，PBMC为 1.075-1.090，血小板为1.030-1.035； 聚蔗糖-泛影葡胺（F-H）分层液法： 原理： F-H分层液密度为1.077，将PBMC层加于分层液上?离 心?不同层次液体和细胞区带 （三）淋巴细胞的纯化与亚群分离 1、去除红细胞：低渗溶解；0.89%氯化铵处理法 2、去除单核、粒细胞： PBMC ?玻璃、塑料平皿黏附去除 3、尼龙毛柱分离法： B细胞易黏附尼龙毛，过尼龙毛柱可分离 T、B细胞 4、流式细胞术分选法：基本原理：流式细胞仪可快速、灵敏和 高度自动化地对单个细胞进行多参数定量测定分析，从而分选 特异性荧光抗体标记的阳性细胞 （四）单核/巨噬细胞的分离和收集 1、平皿黏附分离法 2、斑蝥敷贴法：原理：用斑蝥酒精浸出液贴敷前臂内侧皮肤， 诱发无菌皮炎，收集皮泡渗出液中来自皮下组织的?? 3、硫基乙醇酸盐肉汤培养基?小鼠腹腔?收集腹腔渗出?? 二、淋巴细胞及亚群的检测 根据细胞表面标志鉴定淋巴细胞亚群及检测计数 1、T细胞检测 1）间接免疫荧光法：原理：抗CD抗体与PBMC结合?加入荧光 素标记的羊/兔抗小鼠IgG抗体(荧光标记二抗)?荧光显微镜计数 2）免疫组织化学法：原理：酶标记抗体与组织切片或细胞涂片 反应, 结合?加入底物?酶催化底物显色?普通光学显微镜检测 表面标志?鉴定细胞种类、亚群 2、B细胞检测 1）膜表面免疫球蛋白（SmIg）检测：应用抗Ig抗体借助直接免 疫荧光法或免疫组织化学法检测 2）间接免疫荧光法, 同T细胞 三、免疫细胞的功能测定 （一）吞噬细胞功能测定： 1、中性粒细胞趋化功能测定 滤膜渗透法（Boyden小室法）：上室加待测细胞，下室加趋 化成分，中间用微孔滤膜隔开?反应?滤膜清洗、固定、染色 透明?普通光学显微镜观察细胞穿膜移动距离?判断趋化功能 2、中性粒细胞吞噬杀菌功能测定 NBT（硝基蓝四氮唑还原）试验：原理：中性粒细胞吞噬杀 菌代谢?释放氢?摄入的NBT接受?胞浆沉积黑色颗粒? 10% ? ? NBT+ 3、巨噬细胞吞噬功能测定：原理：用斑蝥酒精浸出液贴敷法收 集人?? ，用腹腔渗出法收集鼠?? ，体外进行鸡红细胞(有胞 核)吞噬实验，计算吞噬百分率、吞噬指数 4、巨噬细胞细胞毒测定：测定?? 对放射性核素51Cr、 125IUdR 标记靶细胞P815的杀伤活性 51Cr标记靶细胞：51Cr渗透入细胞浆，细胞破坏?释放51Cr 于上清中 125IUdR标记靶细胞： 125IUdR掺入细胞DNA，细胞破坏? 酶切DNA ?释放 125I 于细胞沉淀中 将效/靶按一定比例混合?