TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒使用说明书.PDFVIP

TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒使用说明书 （通用型，适用于细胞、组织样本） 【试剂组成】 组 份 规格：20T 规格：50T 规格：100T 储存条件 平衡液 1.0 mL 2.5mL 5.0 mL -20℃ TdT酶 80μL 200μL 400μL -20℃ 50×蛋白酶K 40μL 100μL 200μL -20℃ Streptavidin-HRP 10μL 25μL 50μL 4℃避光 Biotin-dUTP 20μL 50μL 100μL -20℃ DAB 2mg 5mg 10 mg -20℃避光 【技术背景】 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理细 胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡 时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNAladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH 可以在末端脱氧核苷酸转移酶(TerminalDeoxynucleotidylTransferase,TdT)的催化下加上生 物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普 通光学显微镜检测到凋亡的细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有 3-OH形成，很少能够被标记。这就是TUNEL(TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling)法检测细 胞凋亡的原理。 本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原 位检测。 【注意事项】 ① 使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。 ② 因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。 ③ 为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。 ④ TdT酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免 每个样本单独配制而产生的试剂损耗。 ⑤另因DAB为固体粉末，使用前加入适量PBS 溶解，配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按 下述方法显色使用。 ⑥用户自备：二甲苯、多聚甲醛、甲醇、乙醇、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染 染液：苏木素或甲基绿等；盖玻片、载玻片、染色缸、染色湿盒、光学显微镜、37℃孵箱、 移液器等。 1 【样本预处理】 TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需 根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件，如处理时间、处理浓度等，来优化出适合 自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。 1、对于细胞样本 a、 把准备好的细胞涂片或爬片自然晾干。 b、 把晾干的样本浸入固定液，室温（15-25℃）固定15-60min。 （固定液的配制：4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鲜配制） c、 把固定好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。 d、 把c步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。 （封闭液的配制： 3%HO溶于无水甲醇） 2 2 e、 把d步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。 f、 把e步处理好的样本浸入通透液中，冰上（2-8℃）促渗2min。 （通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需