毛细管电泳分离技术.ppt

1、毛细管区带电泳(CZE)  毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE) 是毛细管电泳中最基本的操作模式，应用最广泛，是其它操作模式的母体。 分离原理：由于各组分间荷质比的差异，混合组分处在背景电解质溶液中，在外加电场作用下便获得分离，即CZE是基于溶质的湍度差异进行分离的。 2、胶束电动毛细管电泳(MECC) 胶束电动毛细管电泳（micellar eletrokinetic capillary chromatography,MECC）是以胶束为假定固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的结合。 它是在电泳缓冲溶液中加入高于胶束临界浓度（CMC）的表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），其疏水基团聚集形成胶束，基于各组分溶质在水相和胶束之间的分配系数不同，而获得分离。 不仅能分离离子化合物，还能分离中性化合物。 分离过程：在电场作用下，体相溶液在EOF带动下流向阴极，表面带负电荷的胶束泳动方向与EOF方向相反，一般EOF速度大于胶束泳动速度，因此胶束净迁移向阴极。溶质在流速大的体相水溶液和流速相对较缓慢的假固定相胶束间进行分配。 3、毛细管凝胶电泳(CGE) 毛细管凝胶电泳：它是用多孔性的凝胶或其他筛分剂作介质，因凝胶的网状结构类似于分子筛的作用，流经凝胶的试样，按分子的大小分离。 筛分剂 凝胶材料：化学共价或交联方式形成的胶状多孔物质，成型后很难改变。 聚丙烯酰胺凝胶 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 非凝胶材料：缠绕的聚合物以物理方式组成的物质，较易随容器不同改变形状。 甲基纤维素 优点：1、毛细管凝胶电泳分离度极高。电泳技术和平板凝胶电泳的结合。 2、电泳峰尖锐，柱效极高。凝胶黏度大，抗对流，溶质扩散减少，限制了谱带展宽。 3、组分在短柱上能有极好的分离。溶质与凝胶可形成络合物，增加了分离度，防止了 溶质在毛细管壁的吸附，减少了电渗流。 缺点: 制备柱较困难，寿命较短。 毛细管凝胶电泳优缺点 4、毛细管等电聚焦(CIEF) CIEF：是建立在不同蛋白质或多肽之间等电点差异基础上的分离方法。分离两性电解质，分辨率高（区分0.01 pH ）。 蛋白质的等电点（PI）：指蛋白质的分子的表观电荷数为零时的pH值。 方法是按进样——等电聚焦——检测三步进行 蛋白质与两性溶液混合进样 蛋白质与两性溶液混合进样 1、施加电压，两性电解质迁移，在毛细管柱中形成pH梯度 2、被分离物质迁移至其等电点的pH区域，停止移动 注意：电渗流的存在会破坏稳定的聚焦区带。 解决方法：通过管壁涂层使电渗流减少到最小，可防止蛋白质吸附及破坏稳定的聚焦区带。 第三节　毛细管电泳装置 直流高压电源、毛细管、进样装置、检测器和记录仪等 高压电源可对毛细管施加5~50 kV电压，操作电压一般控制在5~30 kV范围。 CE通常使用内径10~100 μm、长12~120 cm (内涂聚酰亚胺) 弹性融凝石英毛细管，毛细管的两端分别浸泡在含有缓冲溶液的贮液槽中，毛细管内也充满同样的缓冲溶液。 被分离试样可以采用流体动力学进样和电动进样方式由毛细管一端进入。 一、毛细管电泳的进样技术 毛细管内径小于100μm时，注射器进样比较困难。 （一）电动进样 （二）流体动力学进样 （一）电动进样 三 步： 毛细管的进样端插入装有试样溶液的试样管中，试样管中插入电极， 与检测段的缓冲液间施加进样电压，并维持一定时间，试样溶液在电泳和电渗流作用下进入毛细管， 然后再将试样溶液换成缓冲液，电泳即可进行。改变进样电压和进样时间，便可改变进样量。 （二）流体动力学进样 流体动力学进样：也称虹吸进样、重力进样和压差进样。 将毛细管插入试样溶液容器，通过进样端加压，或调节进样端试样溶液液面高于出口端缓冲液液面高度，利用虹吸现象，试样在压力差作用下进入毛细管进样端，再把进样端放回缓冲液液槽中，进行电泳。 二、毛细管电泳检测器 由于样品区带在高压电场作用下，迁移速度较快，因此，CE要求所用的检测器必须具有很快的响应速度和很高的灵敏度。 光学检测器（紫外检测器和荧光检测器） 电化学检测器 质谱检测器 核磁共振检测器 紫外检测器 根据比耳定律，光度测量值A与吸收光程成正比。 一般检测中，检测最大光程是用毛细管内径，而毛细管内径增大受焦耳热影响的制约，因此采用细内径毛细管柱时，测量灵敏度受到限制。 第四节　毛细管电泳技术的应用研究进展 　毛细管电泳技术的特点 类别 特点 速度 快速，可于几分钟内完成复杂成分的分离 分辨率 带展宽有限，分辨率高 灵敏性