利用rna干扰技术研究parp1在氢醌细胞毒性及的dna甲基化过程中的作用.docx

利用RNA干扰技术研究PARPl在氢醌细胞毒性和DAN甲基化过程中的作用所导致的DNA损伤是通过碱基切除修复(BER)途径进行修复的。所以我们将 利用RNA干扰技术研究PARPl在氢醌细胞毒性和DAN甲基化过程中的作用 所导致的DNA损伤是通过碱基切除修复(BER)途径进行修复的。所以我们将 使用HQ作为毒物，来研究PARPl的DNA修复功能。 研究目的 本研究通过构建以RPJ基因的发卡样siRNA(small interfere RNA)真核表达 载体，利用siRNA载体来抑制PARPl基因的表达，从而探索PARPl蛋白在氢醌 细胞毒作用以及DNA甲基化过程中的作用，为进一步研究PARPl的功能奠定基 础。 1、材料与方法 1．1材料 1．1．1细胞 人支气管上皮细胞(HBE)由广州医学院馈赠，细胞以DMEM／10％FCS， 37℃，5％C02培养，常规培养传代。 1．1．2菌株 大肠杆菌DH5 Q菌株由本教研室保存。 1．1．3质粒载体 RNAi。Ready pSIREN．Retro Vector购于美N Clontech公司，全长6．4kb，是 一带有BamH I和EcoR I两酶切位点的线性载体；pEGFP—C1绿色荧光蛋白载体购 于美国Clontech公司，全长4．7kb。 1．1．4主要试剂 细胞培养试剂：DMEM培养基(美国GIBCO—BRL公司)；小牛血清(杭州 四季青生物制品公司)；胰蛋白酶(美国AMRESCO公司)。载体克隆试剂：T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)，PEG8000(美国AMRESCO公司)，酵母抽提物 和胰蛋白胨(OXOID公司)；DNAmarker DL 2000和DNAmarker DL 15000 (TaKaRa公司)；氨苄青霉素(哈尔滨制药厂)；限制性内切酶Bgl II，EcoR I (TaKaRa公司)；卡那霉素(哈尔滨制药厂)；琼脂粉(日本进口分装)。真核转 染试剂：高效质粒小量制备试剂盒，Lipofectamine 2000 Transfection Reagent，新 霉素G418(美国Invitrogen公司)。WESTERN Blot试N-DTT、丙烯酰胺、甲 叉双丙烯酰胺(BBl分装)；Aprotinin(德国Roche公司)；过硫酸胺、甘氨酸 (AMRESCO公司)，SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Kits 一3一 利用RNA干扰技术研究PARPl在氢醌细胞毒性和DAN甲基化过程中的作用(Pierce公司)；Q—tublin(美国Santa 利用RNA干扰技术研究PARPl在氢醌细胞毒性和DAN甲基化过程中的作用 (Pierce公司)；Q—tublin(美国Santa Cruz公司)；TEMED、TritonX．100、Tween20 (加拿大SANGON公司)，钒氧酸钠、SDS(Sigma公司)，考马斯亮兰染色溶 液(美国BIO—RAD公司)。其它试剂：DMSO、Tris碱、EDTA、NaOH、HCl、 冰乙酸、乙酸钾、乙醇、异丙醇、氯仿等均为国产分析纯。 1．2方法 1．2．1发卡样PARPl基因siRNA逆转录病毒载体构建 根据GenBank提供的PARPl基因cDNA序列，通过BD公司提供的软件以 及BLAST挑选长为19个碱基的特异性寡核苷酸序列(5’．ATCTTCT CAAGGCAGACAC一3’)，合成其发卡样两端配对siRNA寡核苷酸链，同时合成 互补链，分别在5 7和3 7端引入BamH I和EcoR I酶切位点。将上下链经过变 性、复性后形成双链PARPl siRNA。采用DNA重组技术，将PARPl siRNA双 链定向克隆入U6启动子指导的逆转录病毒表达载体RNAi—Ready pSIREN．RetroQ Vector。转化连接子，37℃培养过夜，长出的单个单菌落为转化 菌菌落。挑单菌落种于10mlLB(含60ug／ml氨苄青霉素)中，37℃摇菌过夜。 收集细菌，按说明书操作小量快速抽提质粒DNA，1％的琼脂糖凝胶电泳检测结 果。同时构建阴性对照siRNA设计逆转录病毒载体。 1．2．2 pEGFP．C1-PARPl siRNA真核表达载体构建 选择酶切位点，将包括U6启动子和siRNA序列的片段切下，并亚克隆至入 CMV启动子指导的pEGFP—C1荧光蛋白表达载体。转化连接子，37℃培养过夜， 长出的单个单菌落为转化菌菌落。挑单菌落种于10 mlLB(含50 p g／ml卡那霉素) 中，37℃摇菌过夜。收集细菌，按说明书操作小量快速抽提质粒DNA，1％的 琼脂糖凝胶电泳检测结果。并将抽提的部分质粒送上海生工生物工程技术公司测 序鉴定，测序正确的命名为pEG