卷曲乳酸杆菌zj00先1s层蛋白基因结构及其表达产物的粘附和锚定功能研究.docx

1．9抗S．层蛋白抗体对卷曲乳酸杆菌ZJ001粘附HeLa细胞的抑制作用．．551．10 1．9抗S．层蛋白抗体对卷曲乳酸杆菌ZJ001粘附HeLa细胞的抑制作用．．55 1．10 LiCI处理对乳酸杆菌拮抗病原菌粘附HeLa细胞的影响 ．55 1．11卷曲乳酸杆菌ZJ001 S．层蛋白对病原菌粘附HeLa细胞的抑制作用．55 2结果与分析 56 2．1乳酸杆菌S一层蛋白的SDS—PAGE检测 56 2．2培养时间和体外连续传代对卷曲乳酸杆菌ZJ001 s．层蛋白表达的影响 ．56 2-3 S．层蛋白对卷曲乳酸杆菌ZJ001生长特性的影响 57 2．4 S．层蛋白对卷曲乳酸杆菌ZJ001自身凝集和血凝活性的影响 58 2．5 S．层蛋白对卷曲乳酸杆菌ZJ001粘附力的重要性 59 2．6 LiCl处理对乳酸杆菌拮抗病原菌粘附HeLa细胞的的影响 60 2．7卷曲乳酸杆菌ZJ001 S．层蛋白对病原菌粘附HeLa细胞的抑制作用 61 3讨论 ．62 参考文献 64 第三章卷曲乳酸杆菌ZJ001株S一层蛋白基因序列分析、自身组装和粘附功能研 j乞 ． ． ．69 1材料和方法 70 1．1菌株、质粒、细胞和引物 ．70 1．2主要试剂 ．．70 1．3卷曲乳酸杆菌ZJ001株S．层蛋白基因的PCR扩增和序列分析 71 1．4 RT-PCR分析slpA和slpB基因在卷曲乳酸杆菌ZJ001内的转录 ．．72 1．5 slpA和slpB多肽在大肠杆菌内的表达 ．72 1．6抗slpA和slpB蛋白多克隆抗体的制备 72 1．7 Western blot ．．72 1．8间接ELISA ．73 1．9电镜观察slpA和slpB蛋白的体外结晶形成 73 1．10 HeLa细胞对固定S．蛋白的粘附作用 ．．73 2结果和分析 73 2．1 S．层蛋白基因序列分析 73 2．2 S．层蛋白基因在卷曲乳酸乳酸杆菌ZJ001内的转录 75 2．3卷曲乳酸杆菌ZJ001表面S．层蛋白slpA 77 2．4 slpA和slpB蛋白之间的交叉反应性 ．77 2．5 S．层蛋白的体外自身组装 78 2．6 S．层蛋白对HeLa细胞的粘附作用 79 3讨论 ．81 ．III． 参考文献 参考文献 83 第四章卷曲乳酸杆菌ZJ001株s．层蛋白基因簇分析 87 1材料和方法 88 1．1细菌和引物 ．88 1．2主要试剂 ．89 1．3卷曲乳酸杆菌ZJ001株J勿片段的PCR扩增和序列分析 ．89 1．4 PCR检测stpA和s勿曰基因位置互颠的可能性 89 1．5培养条件对slpA和s勿B基因转录和表达的影响 89 2结果与分析 90 2．1 s勿基因片段的序列分析 _ ．．90 2．2需氧和厌氧培养条件下形成的菌落形态 ．91 2．3 slpA和slpB基因位置的互颠 ．91 2．4在需氧和厌氧环境中，S．层蛋白基因的转录和表达 ．．92 3讨论 ．94 参考文献 96 第五章卷曲乳酸杆菌ZJ001株slpA蛋白的粘附和膜锚定结构域分析 ．．98 1材料和方法 99 1．1细菌、质粒、细胞和引物 ．99 1．2主要试剂 ．99 1．3卷曲乳酸杆菌slpA蛋白SAN和SAC结构域的序列分析 ．．100 1．4 slpA蛋白两个结构域与eGFP在大肠杆菌内的融合表达和纯化 ．100 1．5融合蛋白对HeLa细胞的粘附作用 ．100 1．6融合蛋白的膜锚定作用 100 1．7 eGFP．SAC对其他乳酸杆菌分离株的锚定作用 ．101 2结果和分析 ．．1 01 2．1 SAN和SAC的序列分析 ．．101 2．2 SAN和SAC与eGFP在大肠杆菌中的融合表达 102 2．3融合蛋白对HeLa细胞的粘附作用 _ ．103 2．4融合蛋白对乳酸杆菌的膜锚定作用 1 04 3讨论 ．．1 05 参考文献 ．1 06 结论与展望 110 攻读博士期间的发表或已投稿的学术论文 112 致谢 ．．1 1 3 ．IV． 摘要乳酸杆菌是人和动物消化道和生殖道中的正常微生物菌群之一，可通过生物 摘要 乳酸杆菌是人和动物消化道和生殖道中的正常微生物菌群之一，可通过生物 拮抗、改善菌群生态平衡和提高机体免疫功能等方面在动物生产中发挥其益生素 作用。S．层蛋白(S-layer protein)是许多细菌表面的主要蛋白成分，分子量为 40．200 kDa，占茵体总蛋白的10．15％，一般为弱酸性(pI为4．6)。乳酸杆菌 S．层蛋白是目前最小的已知S．层蛋白，分子量在25．71 kDa之间，为碱性(pp9)。 只有少数乳酸杆菌S．层蛋白的结构已经清楚，但大部分功能尚不清楚。国内对