HHV8ORF57启动子中应答元件在RTA激活和IF7抑制基因表达中的作用.docx

l[111 1 II r II r TII I I II IIl Y1 8493 1 0 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取 得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任 何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的 研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文 原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 割瞳龌 2010年5月20日 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申请 和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本说明 为空白。 论文题目 申请密级 口限制(≤2年) 口秘密(≤10年) 口机密(≤20年) 必威体育官网网址期限 20 年 月 日至20 年 月 日 审批表编号 批准日期 20 年 月 日 限制★2年(最长2年，可少于2年) 秘密★10年(最长5年，可少于5年) 机密★20年(最长lO年，可少于10年)  摘要 摘要 人类8型疱疹病毒(human herpesvirus 8，HHV-8)也称卡波西肉瘤相关疱疹 病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)，是艾滋病患者最常见并发 症一卡波希肉瘤的致病原。与其它疱疹病毒类似，HHV-8感染也会经历潜伏和 裂解周期，潜伏向裂解复制的转换由HHV-8开放阅读框(open read啦frame， ORF)50基因编码的复制与转录激活蛋白(replication and transcription activator, RTA)来控制。RTA可以通过与靶基因启动子上的RTA应答原件(RTAresponse element,I眦)直接结合而激活下游病毒基因的转录，这些下游基因包括PAN、 K2、K9、K14、OI疆37、ORF52、ORF56和ORF57基因等。病毒的ORF57基 因编码一个称为mRNA转录物积累蛋白的病毒早期核蛋白，是控制病毒复制从 早期到晚期转换的关键。 OI疆57启动子中的40 bp区段(nt 81904-81943)介导RTA的转录激活。在 此区段中已发现两个富含AT的RTA应答元件，分别称为RREl和RRE2，其中 RREl与病毒K8启动子序列同源，而RRE2不仅结合RTA，还能结合宿主编码 的干扰素调节因子7(interferon regulatory factor 7，IRF．7)。RTA和IRF-7对RRE2 的竞争影响RTA对ORF57启动子的转录??活，并调控病毒的活化。在RREl和 RRE2之间有一个7 bp的重组信号序列结合蛋白JK(recombination signal-binding protein k RBP-JK)识别位点，可能参与RTA与RRE的结合。 为研究HHV-8 ORF57启动子40 bp区段中的各元件对RTA和IRF．7的应答， 以及寻找该区段外新的IU冱，本文利用上游引物l一5和下游引物6或7扩增 ORF57启动子片段，分别插入到pGL3．basic载体来构建系列缺失型报告质粒 S1-$5和L1．L5，它们分别包含ORF57启动子中从nt 81556，81904，81918，81930 或81944到转录起始位点1(m 82003)或转录起始位点2(nt 82081)之间的序 列。此外还对元件进行不同组合构建出报告质粒CI-C8，以检测应答元件的数目 和距离对RTA激活和IRF．7抑制的影响。 以S1-s5报告质粒单独转染或与RTA和IRF．7表达质粒共转染293T细胞， 测定萤火虫荧光素酶活性，发现RREl对于RTA的转录激活非常关键，缺失RREl 的报告质粒对RTA几乎没有应答。用同样方法检测Ll-L5报告质粒，发现缺失 RREl的报告质粒仍保留对RTA和IRF．7的应答，直至进一步缺失掉RBP-JK位 点才彻底丧失对RTA和IRF．7的应答能力。比较S系列与L系列报告质粒的转 染结果发现，在两个转录起始位点之间，即nt 82003和82081之间的78 bp区段 中可能存在一个新的功能性RRE，它能介导RTA的转录激活，还能弥补由于缺  摘要 失RREl造成的对RTA应答的缺失。我们将这个新鉴定的功能性RRE命名为 RRE4，对其精确位置和作用机制还有待于进一步深入的研究。共转染IRF．7表 达质粒发现，IRF．7除了能有效抑制RREl介导的RTA激活外，还能抑制RRE4 介导的RTA激活，暗示IRF．7对临近RRE的抑制不表现出方向性。 Cl-c8报告质粒的转染结果显示，增