L型钙离子通道阻滞剂贝尼地平C57BL6小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的体内外研究.docx

博士学位论文 司)，胎牛血清(Gibco公司)。 2．BMSCs的提取与培养 小鼠寰枢椎脱臼处死后75％酒精浸泡消毒5分钟，在超净台中用眼科剪和 眼科镊剥开小鼠皮肤，从髋臼关节处取下小鼠双下肢，PBS清洗掉粘连毛发， 剥离附属肌肉等软组织整理出股骨，浸泡于0【．MEM基础培养基中，用一套新的 灭菌眼科剪和眼科镊剪开股骨双侧骨端暴露骨髓腔，用1 ML注射器吸取 10％FBS的完全培养基冲出骨髓，反复并两端交换冲洗，待骨头发白后将含有骨 髓的完全培养基转移至干净的15 ML离心管，800 r／min低速离心5分钟，骨髓 重悬后转移至10 cm培养皿中5％的C02下37。C培养，培养基3天更换1次。 3．细胞实验的分组与处理 取第3代生长良好的小鼠BMSCs按1×10 5个／孔密度接种于6孔板，待细 胞融合率达到90％以上时，将细胞分为2组，对照组：成骨诱导培养基培养； 贝尼地平处理组：成骨诱导培养基条件下分别以l、10和100 gmol／L贝尼地平 培养。成骨诱导培养基各成分比例为100 nmol／L的地塞米松，50 lag／ml的维生 素C磷酸酯，10 mM／L的p．甘油磷酸钠。药物连续处理14天，3天更换1次培 养基，370C，5％C02条件下培养。 4．CCK8检测贝尼地平对BMSCs的细胞毒性 第3代BMSCs种于96孔板中，细胞的种植密度为1×105个／孔，培养2天 后对细胞进行加药处理，加入贝尼地平浓度分别为0．1、l、10、100和1000 Iunol／L， 加药处理1天，使用Caspase．8比色测定工具包(CCK8)进行药物细胞毒性检 测。每孔加入10止的CCK8溶液和90此的Ⅱ．MEM基础培养基，使用酶标仪 测量各孔吸光度(optical density,OD)，CCK8溶液吸收波长为450 nm。 5．ALP染色实验 第3代BMSCs种于6孔板中，细胞成骨诱导并加入贝尼地平(1～100 IJmol／L) 处理14天后，对细胞行ALP染色。具体步骤为：洗去细胞培养基，使用无菌 PBS轻柔冲洗2次，每孔加入2 ml的4％多聚甲醛室温固定20分钟；PBS冲洗 III 万方数据  摘要 3次，每次3分钟，洗掉多余多聚甲醛；按照使用说明书配制ALP染液，现配 现用，配好ALP染液避光保存；每孔细胞加入ALP染液1 ML避光370C孵育 半小时；PBS冲洗3遍，???遍3分钟，终止染色。光镜下拍照，Image．Pro Plus software(IPP，美国)软件计数阳性细胞数。 6．Western blotting检测Runx2、OCN、GAPDH、p-catenin和LRP5的表达水 平 对细胞成骨诱导并加入贝尼地平(1～100 lamol／L)处理14天后，在冰上用 蛋白裂解缓冲液裂解细胞，收集蛋白，样品金属浴960C处理10分钟，10000 r／min 高速离心1分钟，取上清，-20。c长期储存备用。每条泳道上样30嵋蛋白，用 体积分数(VⅣ)为10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳60分钟，将凝胶中蛋白电泳转移 至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉常温封闭1小时后分别加入一抗(1：2000)冰箱40C 过夜孵育，室温TBST溶液清洗3遍，每遍5分钟，二抗(1：3 ooo)常温孵育1 小时，增强化学发光(ECL)发光试剂显色摄像。条带用Image J软件分析，测定 灰度值。目的条带与对应的GAPDH条带灰度比值为统计结果。 7．动物材料 雌性10周大C57／BL6小鼠，体重20～239，购至内蒙古农业大学实验动物 中心；主要实验仪器与试剂：(1)主要仪器：倒置光学显微镜(Nikon，TE2000．U)， 荧光显微镜(Olympus，FV-1000)，显微CT(SCANCO Medical，pCT80)，石 蜡切片机(Leica公司)(2)主要试剂：一抗Runx2(CST公司)，一抗OCN(CST 公司)，偶联异硫氰酸荧光素山羊抗兔二抗(Abcam公司)，伊红(Sigma公司)， 苏木素(Sigma公司)，乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine TetraaceticAcid，EDTA， Sigma公司)，甘油(Sigma公司)，余试剂均购至Sigma公司。 8．动物饲养与造模 随机将30只lO周大C57／BL6小鼠平均分为3组，分别为：假手术组(Sham)， 去卵巢组(0VX)，去卵巢加药组(OVX+BD)；假手术组切除卵巢周围少量脂 肪垫后缝合，去卵巢组完整切除双侧卵巢，去卵巢加药组在完整切除双侧卵巢 IV 万方数据  博士学位论文 后灌胃贝尼地平20mg／kg／d，正常饮食，常规饲养3个月，断颈处死后取双侧股 骨4C下4％多聚甲醛固定24小时，EFTA．甘油溶液4C脱钙1个月。 9