GB/T 18648-2002非洲猪瘟诊断技术.pdf

GB/T 18648-2002 前 言 非洲猪瘟(Africanswinefever，简称ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、 高度接触传染性疾病 其特征为病程短，病死率高，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，表现高热、 皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。为世界动物卫生组织[WorldOrganizationforAnimalHealth(英)， OfficeIntentionaldesEpizootic(法),OIE]和我国规定的动物一类疾病。病毒在鲜肉和腌肉中能存活数 月。 ASF的实验室诊断分为两类:第一类包括病毒分离、病毒抗原和基因组DNA的检测;第二类包括 抗体的检测。试验方法的选择主要依据本国或本地区的疾病情况而定。在没有ASF但又怀疑该病存在 的国家，实验室诊断必须应用无感染性的诊断方法，即应用聚合酶链反应(PCR)检测病毒基因组DNA 和应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体 我国是无ASF国家，目前尚无ASF的检疫方法。农业部动物检疫所于199?年与美国梅岛动物病 研究中心进行了ASF的无感染性快速检测方法的合作研究，建立了适合于我国使用的由可疑感染动物 血液和内脏器官中直接检测ASFVDNA的PCR技术，以及检测血清中ASFV抗体的ELISA方法。本 标准对这两种方法技术要求作了规定 本标准的附录A、附录B和附录C都是标准的附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:农业部动物检疫所。 本标准主要起草人:蒋正军、王树双、尹燕博、蔡丽娟、郭福生、陆明哲、孙淑芳、龚振华。 中华人 民共和 国国家标准 GB/r 18648-2002 非洲猪瘟诊断技术 DiagnostictechniquesforAfricanswinefever 范围 本标准规定了非洲猪瘟(ASF)聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)的技术要求。 本标准适用于生猪和野猪等易感动物及其产品ASF的诊断和检疫。 2 PCR试验 2.1 材料准备 2.1.1样品DNA制备方法见附录A(标准的附录)。 2.1.2 电泳液缓冲液的配制方法见附录B(标准的附录)。 2.1.3 标准ASFV-BA株DNA、引物1、引物2,1.25mmol/LdN丁P和载样缓冲液。 2.1.4 台克(Taq)DNA聚合酶、分子量为100碱基对(bp)Ladder(标准DNAMarker)0和10倍浓度 的聚合酶链反应(PCR)扩增缓冲液。 2.1.5 自动DNA热循环仪。 2.2 操作方法 2.2.1将下列试剂按要求量加人到0.75mL的离心管中:灭菌蒸馏水(24.5风);10倍浓度的PCR扩 增缓冲液(5VL);1.25mmol/LdNTP贮存液(8pL);引物 1(1pL);引物2(1pL);样品DNA溶液 (10JAI)(见附录A);TaqDNA聚合酶(。.5PI)。 2.2.2 设定两个对照，阳性对照为标准的ASFV-BA，株的10pLDNA含量为10fg;阴性对照为不含 DNA的灭菌蒸馏水 10讨 。 2.2.3 取50pl矿物油覆盖在混合液上。 2.2.4 将加有样品或对照混合物的Eppendorf管放人自动DNA热环仪中，按下述程序和条件进行 DNA扩增 94C5min,50一C2min,72C3min循环一次;94C1min,50C2min,72C3min循环30次; 94C1min,50C2min,72C10min循环一次，最后置于4C保存。 2.2.5 上述步骤完成后，从矿物油下小心取出每种反应混合物20pL，放人另一支干净的Eppendorf 管中并加2pL载样缓冲液。 2.2.6 将所有样品按编号加人到对应2%琼脂凝胶(见附录B1)板的各孔中，其中一孔加标准阳性 DNA样品。在凝胶的边孔中加人标准分子量DNAMarker, 2.2.7 将凝胶在150v恒定电压下电泳2ha 2.2.8 结果判定:用紫外光源检查凝胶。如为阳性样品，则出现一条孤立的、与阳性对照PCR产物的同 步迁移的带，分子量为265bp,阴性对照和非ASF感染猪无265by带。 3 酶联免疫吸附试验(ELIS