Primer-Express-TaqMan引物探针设计.pdfVIP

Primer Express TaqMan 引物探针设计 一、 安装软件 ABI 公司 Primer Express v3.0 Primers and Probe Design For Real-Time PCR 二、 Primers/Probes Design Guideline TaqMan Probe Primer Probe 与 Primer 的距离愈近愈好, PCR 产物大小建议在50-150 bp 为最佳 G/C % 为 30-80 % 避免有重复序列的出现，尤其避免4 个以上G 的出现 Tm 值: 68-70℃(Quantification assay) Tm 值: 58-60℃ 65-67℃(Allelic Discrimination assay) Probe 长 : Primer 长 : 13~25 bases (TaqMan MGB probe) 20 bases (Optimal) 13~30 bases (TaqMan probe) 避免连续6 个A 的序列出现 3’端的前5 个序列里不能超过2 个C+G 5’端第一个序列不能为G (如果选择FAM-dye 在5’端第二个序列也可以为G) 选择C 比G 多的strand 当作probe b 避免 3’端的前4 个序列含有3 个或以上G (GGG-MGB-3’ or GGAG-MGB-3’) a 避免probe 的中间区域含有2 个或以上的CC di-nucleotidesa a. 针对 TaqMan MGB 探针 b. 参数可选择设定 三、Primers Probes （Automatically Design ） ① 进入 Primer Express 3.0 软件 File→ New → 选择 TaqMan MGB Quantification 或 TaqMan Quantification → OK ② Tools →按 Add DNA File ，寻找序列存取位置，按下 Add ，将序列档案加入空白文件。亦可在 Sequence 的界面中使用 Copy Paste 复制和粘贴或直接输入序列。 * Primer Express Software 只能接受 dan, txt, ab1,或 abi 的档案格式 ，请事先将欲分析的序列存成纯文 字档即可(若序列是从 database download 下来时,请刪除与序列无关的资料)。 ③ 可勾选 Double Strand, 即会显示 double stranded DNA sequence。 ④ 各 Tools 选项操作 1. Exclude:不必要的序列可利用 Exclude Selected Bases 将序列划掉。 - 先选取不要的序列范围，点选 “Exclude”，即可看见此区域被划掉。 2. Junction: 如果已经知道序列上 junction 位置则可利用 Junction - 选取 juct ion 的位置(必须含 2 bases) ，再点选 Junction ，即可看见此区域被红色标记起来。 3. 在 Parameters 界面中可看到 Primer/Probe Tm 值设定及其他 Primers/Probe 情况。 4. 回到 Sequence 界面 ，Tools → Find Primers/Probes ，软件即开始找寻找适当的 Primers/Probe pairs。 *Primer Express 软件会找到 Candidate Primers Probe pairs ，一次search 最多能找到 50 种组合， 这些组合列与 Primers / Probes 界面中。中间 Location 说明 primers probes 在序列中的相对位置， 在横线上方