低氧状态下神经干细胞增殖、分化的研究-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

低氧状态下神经干细胞增殖、分化的研究 摘 要 神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)是具有高度自我更新能力和多向分化潜 能的神经祖细胞(Neural progenitor cells, NPCs)。它能分化成神经元和神经胶质细 胞，因此对治疗神经退行性疾病和损伤有着广阔的应用前景，目前己成为神经领 域的研究热点。氧是生命存在的必要条件，也是细胞生理功能的一种重要调节因 子，氧浓度的变化可影响细胞的功能状态。目前关于低氧作用的研究多集中在对 细胞的损伤和有关的适应机制方面，而对细胞增殖和分化中的作用研究较少，特 别是低氧对 NSCs 增殖和分化的影响还存在争议。促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)是一种新的神经营养和保护因子，有研究表明它在 NSCs 增殖、分化中起着 重要的调控作用，但它是否参与低氧时对 NSCs 增殖和分化进行调节报道较少。因 此，本研究利用细胞分子生物学手段，观察低氧对 NSCs 增殖和分化的影响，检测 了低氧后 NSCs 及其分化细胞内 EPO 的表达情况，并探讨低氧状态下 EPO 在诱导 NSCs 增殖和分化过程中的作用。 第一部分 神经干细胞分离、培养和鉴定 目的 体外分离培养较高纯度的 NSCs。 方法 取孕 13~14 d 大鼠胚胎脑皮层，制成单细胞悬液，以 1x105/ml 密度接种、培 养，于培养的第 3 d 半量换液，换液前将聚集的细胞团块打散，于第 7 d 取细胞球 行 Nestin 鉴定。神经干细胞分化后分别进行 GFAP 和 NSE 鉴定。 结果 Nestin 鉴定结果表明培养的细胞呈免疫反应阳性，为神经干细胞，且较纯。 神经干细胞分化细胞的 NSE 和 GFAP 鉴定表明，部分细胞呈 NSE 免疫反应阳性， 为神经元、另一部分细胞为胶质细胞。 结论 成功的培养出了神经干细胞，且纯度较高，可用于下面的实验。 关键词 神经干细胞；培养；鉴定 第二部分 低氧对神经干细胞增殖、分化的影响 目的 观察低氧对 NSCs 增殖、分化的影响。 方法 将三代 NSCs 分为对照组和低氧组，分别置于 5% CO2 培养箱和三气培养箱 (氧浓度为 10%)中培养。采用克隆细胞球计数法、MTT 法检测细胞增殖情况；神 经干细胞分化后行免疫细胞化学染色检测细胞分化成神经元和神经胶质的比率。 结果 细胞培养 7 d 时对照组和低氧组 NSCs 的克隆形成率分别为(21.26±2.16)%和 (48.93±4.34)%。低氧组，神经干细胞增殖活力 OD 值明显高于对照组；神经干细 胞分化成神经元的比例比对照组高 25.2% (p0.05)。 结论 适度低氧能够促进 NSCs 增殖，促进 NSCs 向神经元方向分化。 关键词 低氧；神经干细胞；增殖；分化 第三部分 EPO 对低氧状态下神经干细胞增殖、分化的影响 目的 观察低氧状态下 NSCs 及其分化细胞 EPO 基因的表达情况，探讨外源性 EPO 对低氧下 NSCs 增殖、分化的影响。 方法 低氧环境设置同第二部分。分别于低氧 3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 采用 Western-blot 检测 NSCs EPO 蛋白的表达情况。胎牛血清诱导 NSCs 分化后，采用 RT-PCR 检测 EPO mRNA 的表达情况。 采用克隆细胞球计数法、MTT 法、免疫细胞化学染色等方法检测外源性 EPO 对低氧状态下 NSCs 增殖、分化的作用。 结果 Western-blot 检测结果显示:对照组 EPO 蛋白表达较低，而低氧组在 3~48 h 内都有表达，以 12 h 表达量最高。NSCs 分化的细胞在低氧 3 h 时，EPO 在 mRNA 水平表达量比对照组明显增加，24 h 时表达量最高。施加外源性 EPO 后，NSCs 的克隆形成率与对照组比较 p0.05，有统计学意义；EPO 组细胞 OD 值比对照组 明显增高。EPO 组的 NSE 阳性细胞比对照组增加 21.7% (p0.05)，差异有统计学 意义。 结论 低氧能够提高 NSCs 及其分化细胞内源性 EPO 基因的表达；外源性 EPO 能 够促进低氧状态下 NSCs 增殖，促进 NSCs 向神经元方向分化。 关键词 促红细胞素；神经干细胞；增殖；分化；表达 Study of proliferation and differentiation of neual stem cells in the state of hypoxia Abstract Background Neural stem cells (NSCs), which exist in the developing and adult mammalian brain, are self