弓形虫HSP70基因重组质粒的构建及其诱导小鼠的细胞免疫应答-病原生物学专业论文.docxVIP

山西医科大学硕士学位论文 山西医科大学硕士学位论文 PAGE PAGE 4 弓形虫HSP70基因重组质粒的构建及其诱导小鼠的细胞免疫应答 摘 要 目 的 构建弓形虫 RH 株 p3×Flag-CMW-14-TgHSP70 真核表达重组质粒。观察不同剂量的重 组质粒 p3×Flag-CMW-14-TgHSP70 皮下肌肉注射免疫 BALB/c 小鼠诱导的细胞免疫应答动 态变化。 方 法 第一部分：设计合成 TgHSP70 引物，PCR 扩增其基因片段，获得弓形虫速殖子热休 克蛋白（TgHSP70）基因编码片段，双酶切后与真核表达质粒 p3×Flag-CMW-14 连接，连 接产物经酶切、PCR 及测序鉴定。脂质体法将重组体转染 HEK 293T 细胞中，TgHSP70 的 表达产物通过 RT-PCR 和 Western blot 在基因和蛋白两个水平进行鉴定。 第二部分：125 只 BALB/c 小鼠随机均分 5 组，分别用 50μg、100μg、150μg 重组质 粒 p3×Flag-CMW-14-TgHSP70/只皮下肌肉注射免疫小鼠 3 次，各间隔 2 周，空白对照组注 射 100μl Elution 缓冲液，空质粒组注射 50μg p3×Flag-CMW-14，重组质粒和空质粒分别溶 于 100μl Elution 缓冲液中。分别于首免后第 2、4、6、8、10 周摘眼球采血，分离血清， 每组 5 只，ELISA 法测定血清中 IL-2、IFN-γ 水平。颈椎脱臼处死小鼠，无菌取脾，分离 脾淋巴细胞并计数；再加入终浓度为 5μg/ml 的 ConA，5%CO2、37℃培养 24h、72h，取培 养上清。ELISA 法测定培养 24h 上清液中 IL-4、IL-2 水平和培养 72h 上清液中 IFN-γ 水平。 结 果 PCR 扩增获得约 495 bp 的 HSP70 编码基因片段，p3×Flag-CMW-14-TgHSP70 重组体 构 建 成 功 ， 阳 性 克 隆 经 双 酶 切 、 PCR 及测序 鉴定 ， 基 因 片 段 序 列 完 全 正 确 。将 p3×Flag-CMW-14-TgHSP70 真核表达重组质粒转染到 HEK 293T 细胞中，经 RT-PCR 检测 可见预期大小的目的基因条带，Western-blot 检测表达产物大小约 19 kDa。 50μg、100μg、150μg 重组质粒组小鼠血清 IL-2 水平在免疫后第 6 周明显上升，第 8 周达到顶峰，第 10 周稍有回落。50μg、100μg、150μg 重组质粒组和对照组的血清 IFN-γ 水平随时间改变基本一致，无明显差异。免疫后第 10 周，50μg 重组质粒组脾细胞数 （17.362×106 个/ml）显著高于 150μg 组（15.22×106 个/ml）、100μg 组（15.66×106 个/ml）、 空质粒组（14.82×106 个/ml）和空白对照组（16.076×106 个/ml）（F=4.478，P0.05）。免疫 后第 2～10 周 150μg 组脾淋巴细胞 IL-4 水平均高于 50μg 和 100μg 组，但差异无统计学意 义。免疫后第 2～10 周，50μg、100μg、150μg 重组质粒组和空质粒组脾细胞 IL-2 水平均 高于对照组，差异显著（F=5.319，P0.05），150μg 重组质粒组显著高于其他各组。免疫 后第 2～10 周，150μg 重组质粒组脾细胞 IFN-γ 水平显著高于其它各组（F=3.918，P0.05）， 并在第 8 周（A405=0.9867）时达到最高值。 imm immunized with 50μg, 100μg, 150μg p3×Flag-CMW-14-TgHSP70 by subcutaneous injection, per mouse 3 times at an internal 2 weeks, control group was injected with 100μl elution buffer, empty vector group were injected with 50μg p3×Flag-CMW-14. Recombinant plasmid and empty plasmid were dissolved in 100μl elution buffer. The murine sera were separated at week 2, 4, 6. 8 and 10 after the first immunization, levels of IL-2 and IFN- γ in sera were measured by ELI