缝隙连接蛋白Cx26在肝细胞癌中的表达及其对奥沙利铂抗肿瘤作用的影响研究-肿瘤学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 1 缝隙连接蛋白 Cx26 在肝细胞癌中的表达及其对奥沙利铂抗 肿瘤作用的影响研究 中文摘要 目的： 检测肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC，简称“肝癌”）癌变过程中 缝隙连接蛋白 26（Connexin26，Cx26）及其组成的细胞缝隙连接（Gap Junction， GJ）功能的改变；在明确其表达基础上，进一步探讨调控 HCC 细胞中 Cx26 及 其组成 GJ 的功能对奥沙利铂（oxalipatin，OXA）抗肿瘤作用的影响。以期为探 讨 HCC 低化疗反应性的机制提供新的资料和理论基础。 方法： 采用免疫组化法检测 20 例正常肝组织及 76 例 HCC 组织中 Cx26 的表达及定 位，在明确 Cx26 有异常表达的基础上，进一步在人正常肝细胞（LO2）及肝癌 细胞（SMMC-7721）上，采用 RT-PCR 和 Western blot 法检测 Cx26 的表达，免 疫荧光法观察 Cx26 的定位，细胞接种荧光示踪法（Parachute assay）测定 GJ 功 能。明确 GJ 功能改变基础上，进一步在 SMMC-7721 细胞上，通过高低密度接 种细胞、GJ 工具药和特异性调控 Cx26 表达等方法调控 GJ 功能，采用 MTT 法 观察 GJ 功能改变对 OXA 抗肿瘤作用的影响。 结果： 1. HCC 癌变过程中 Cx26 及其组成 GJ 功能的改变 1.1 人正常肝组织及 HCC 组织中 Cx26 的表达 免疫组化法检测结果显示：正常肝组织 Cx26 蛋白均表达阳性，而 HCC 组 Cx26 蛋白表达阳性率显著下调至 47.37%（χ2 =18.045，P=0.000）。且在正常肝组 织中，阳性表达的 Cx26 呈线状分布于细胞膜上，偶见细胞质表达；而在 HCC 组织中，阳性染色颗粒主要分布于细胞质内，偶见同时有部分细胞膜着色。蛋白 自细胞膜向细胞质定位改变称为“内化”（ internalization）现象。Cx26 内化率 在正常肝脏组织及 HCC 组分别为 15%和 100%，两组比较有统计学差异（χ2 =43.938，P= 0.000）。 1.2 人正常肝细胞（LO2）及 HCC 细胞(SMMC-7721)Cx26 的表达及 GJ 功能状态 RT-PCR 联合 western blotting 检测结果显示：人正常肝细胞 LO2 中 Cx26 表 达水平相对较高，而肝癌细胞 SMMC-7721 中 Cx26 表达水平较低。免疫荧光实 验表明 LO2 细胞上 Cx26 的膜定位明显，而在 SMMC-7721 细胞上，Cx26 弥散 分布于细胞质中，仅有少量呈细颗粒状定位于细胞膜。进一步使用 Parachute assay 检测 GJ 功能时发现：LO2 细胞 GJ 功能丰富，而 SMMC-7721 细胞 GJ 功能较弱。 2. 调控 HCC 细胞(SMMC-7721)上 GJ 功能对 OXA 抗肿瘤作用的影 响 2.1 OXA 对 SMMC-7721 抗肿瘤作用的影响 MTT 法检测 OXA（0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/ml）作用 24 h、 48 h、72 h 后 SMMC-7721 细胞的存活率，结果显示，随着 OXA 作用浓度和时 间的增加，SMMC-7721 细胞存活率逐渐降低。其中 32、64、128 μg/ml 三个剂 量组抑制作用明显，该剂量级用于后续实验。 2.2 GJ 形成对 OXA 抗肿瘤作用的影响 通过高低密度接种细胞法，分别获得有 GJ 形成细胞和无 GJ 形成细胞，结 果发现 OXA 的抗肿瘤作用在有 GJ 形成细胞显著高于无 GJ 形成细胞（P＜0.05)。 2.3 工具药调控 GJ 功能对 OXA 抗肿瘤作用的影响 2.3.1 工具药对 SMMC-7721 细胞 GJ 功能的影响 Parachute assay 实验结果显示，10 μM 全反式维甲酸（All-transretinoic acid， ATRA）处理 SMMC-7721 细胞 24 h，细胞荧光传递功能显著增强，即细胞间 GJ 功能显著增强，增强率约为 72%；5 μM 18-α-甘草次酸（18-α-glycyrrhetinic acid， 18-α-GA）作用 SMMC-7721 细胞 1 h，细胞荧光传递功能显著降低，即细胞间 GJ 功能显著降低，抑制率约为 63%。 2.3.2 工具药调控 GJ 功能后对 OXA 抗肿瘤作用的影响 MTT 结果表明，10 μM ATRA 单药作用 24 h 对 SMMC-7721 细胞生长无明 显影响，但使用其预处理细胞 24 h 以增强 GJ 功能后，再使用 64 μg/ml O