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第十二章 食品中转基因成分检验 第一节 概述 转基因生物：利用基因工程技术改变基因组的构成， 用于农业生产或者农产品加工动植物、微生物及产品。主要是转基因植物。 转基因食品： ①：转基因动植物、微生物产品，如转基因大豆 ②：转基因动植物、微生物产品直接加工品，如转基因大豆油 ③：以① 和②为原料生产的食品和添加剂，如转基因大豆油加工成的人造奶油。 转基因成分（外源基因成分）：物种本身不具有的，而是来源于其他物种的功能基因序列。 转基因食品的特征 具有其原有基因表达的性状和功能 存在外源DNA的表达产物及其生物活性 基因重组体 载体：自我复制，运载工具 目的基因：转基因生物性状改变直接相关DNA 调控元件：使目的基因表达精确开始和终止，表达增强 标记基因：进行标记以便筛选转化细胞 报告基因：编码某种易于检测蛋白质或酶的基因 外源基因表达的产物主要包括：目的基因、标记基因和报告基因表达的蛋白，或意外表达的蛋白。 使得其具有有传统食物有不同的生物特性，由此产生安全性问题。 第二节 食品中转基因成分检验 检测方法概述 检测流程 采样要求 1 一般规定：所用器具清洁干燥无DNA和蛋白质污染；避免样品散落，防止污染生态环境；短时间内完成，避免样品组成发生变化 2 抽样方法：随机原则；“三层五点”；若加工工程损坏DNA,则加大采样量 采样要求 3 抽样数量：根据转基因限量水平确定每批中应抽取的原始样品最小数量 4 样品制备与保存：分三份，用于检测，复检和备查；及时加贴标签，注明编号、货物名称、品种、抽样时间、抽样人及其他必要信息 外源基因检测 根据检测目的和检测结果特异性水平不同， 检测方法可分为四类： 初筛试验：普遍存在的基因重组通用元件 基因特异性试验：基因重组体中含有的外源基因 组成结构特异性试验：目的基因与调控基因连接处的核苷酸序列 事件特异性试验：插入的基因序列和植物基因组之间的连接区 DNA提取及纯化 为什么要提取纯化？ 植物细胞中DNA主要存在于细胞核和细胞质中，细胞中各种DNA称为总DNA，其中95%以上的DNA是与蛋白质结合存在的。植物细胞中还存在大量多糖、蛋白质、多糖、多酚类物质和RNA等成分。 这些物质都会影响后续DNA的PCR检测。 DNA提取及纯化 转基因成分检测时需要先提取总DNA，利用去污剂或有机溶剂破坏细胞膜，裂解细胞，是DNA与蛋白质分离并游离于提取液中，然后去除杂质成分。 DNA纯化的原理是根据乙醇或异丙醇竞争结合水分子的能力远强于DNA，在DNA提取液中加入乙醇或异丙醇，DNA因溶解度降低而析出。 DNA提取方法 一类：改进的传统方法，如苯酚-氯仿法、溴化十六烷基三甲基胺法（简称CTAB法）、二氧化硅法等。 第二类：试剂盒法，试剂盒法因为操作简便而被广泛应用。 CTAB法 样本准备： 固体样本要研磨成大小在2mm以下的颗粒，也可以用液氮研磨至DNA充分释放并满足DNA提取的要求； 液态样本可以通过离心沉淀、加热蒸发、冷冻干燥等方法得到干物质用于DNA提取。 CTAB法原理 CTAB能溶解细胞膜并能与DNA结合成CTAB-DNA复合物，该复合物可溶解于高盐溶液中（如氯化钠），蛋白质、多糖等物质在此溶解中因溶解度降低而生成沉淀，经离心后与复合物分离；然后将该复合物置于低盐溶液中，因其不溶性而沉淀析出；最后将复合物沉淀溶解于高盐溶液中，加入乙醇使DNA沉淀，离心后获得纯化的DNA。 CTAB法主要试剂 按下表配置试剂，定容至200ml,高压灭菌 DNA质量和纯度检测 琼脂糖凝胶电泳 在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶里进行电泳，紫外灯下观察DNA条带判断 核酸定量检测 紫外分光光度计测定基因组DNA溶液的OD值，OD260/OD280一般在1.7~ 1.9，高了表明有RNA污染，低了表明有蛋白质或有机溶剂污染。 核酸PCR检测 PCR即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。 PCR反应体系是由DNA模版、引物、dNTP 、DNA聚合酶、镁离子和缓冲液等组成。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 我国标准检测方法 核酸PCR定性检测：检测目标基因是否存在 （有没有） 核酸PCR定量检测：检测目标基因存在的量（有多少） 1 核酸PCR定性检测 检测原理是定性PCR检测对象包括转基因食品目的基因、启动子、终止子、标记基因等外源基因和元件。 根据转基因产品的特异性序列设计引物，对试样中外源目的基因进行PCR扩增。依据扩增产物中是否存在预期特异性片段，判断样品中是否含有转基因