丹酚酸B联合Ad-HGF修饰对MSCs存活和分化的影响心血管内科学专业论文.docx

广州医科大学硕士毕业论文 广州医科大学硕士毕业论文 丹酚酸 丹酚酸 B 联合 Ad-HGF 修饰对 MSCs 存活和分化的影响 PAGE PAGE 13 PAGE PAGE 10 cTnT、Desmin、Connexin43 的表达；蛋白印迹法检测心肌细胞特异性蛋白 cTnT 的表达；荧光定量 PCR 检测早期心肌细胞特异标志物 GATA-4 和 Nkx2.5 的表达。 实验结果 1. 成功分离纯化骨髓间充质干细胞，细胞接种 24h 后开始贴壁，呈较大的椭 圆形，48h 后细胞贴壁逐渐增多，呈均匀一致的长梭状，并逐渐形成集落； 2. Ad-HGF 按不同 MOI 感染后细胞生长良好，MOI=200 时细胞感染效率最高 （89.08%），可检测出 HGF mRNA 的表达，在细胞上清液检测到 HGF 稳定 表达，持续约 21d； 3. AO/EB 双重荧光染色显示 Ad-HGF 组和 SalB 组对 MSCs 的存活与对照组比 较无明显差异；MTT 示 Ad-HGF 组和 SalB 组对 MSCs 的增殖（OD 值）与 对照组比较有统计学差异（P＜0.05），两者联合效果更明显（P＜0.05）；然 而，5-Aza 组 OD 值明显较对照组小（P＜0.05）； 4. 在缺氧环境下，Ad-HGF 组和 SalB 组与单纯 MSCs 组相比可有效抑制缺氧 诱导的细胞凋亡，增加细胞的存活率（P＜0.05）；在蛋白水平上上调抗凋亡 蛋白 Bcl-2 的表达和下调促凋亡蛋白 Bax 和 Caspase-3 的表达，与对照组相 比较有统计学意义，并且两者联合作用效果更明显（P＜0.05）； 5. 诱导后，MSCs 体积逐渐增大，形态变圆，2-3w 时可见部分细胞胞体粗大， 胞浆粗糙，在 5-Aza+SalB 组、5-Aza+Ad-HGF 组和 SalB+Ad-HGF 组较 5-Aza 组明显，但单独 Ad-HGF 组和 SalB 组形态改变不明显；免疫荧光化学染色 检测显示经 SalB 作用和 Ad-HGF 感染诱导后的细胞表达心肌细胞特异性蛋 白 cTnT、Desmin 和 Connexin43，蛋白印迹法示 cTnT 特异性条带，荧光定 量 PCR 见 Nkx2.5 和 GATA-4 阳性表达，在 5-Aza+SalB 组、5-Aza+Ad-HGF 组和 SalB+Ad-HGF 组表达较 5-Aza 组强，而 SalB 和 Ad-HGF 较 5-Aza 组 弱，但较单纯 MSCs 组强。 结论 1. 构建的 Ad-HGF 可在 mRNA 和细胞上清液中稳定表达 HGF； 2. SalB 和 Ad-HGF 感染对 MSCs 无损伤作用，能有效促进 MSCs 的增殖，在 缺氧环境中能有效抑制细胞凋亡，两者联合可进一步提高其作用效果； 3. SalB 作用和 Ad-HGF 感染可有效促进 MSCs 向心肌样细胞分化，两者联合 诱导效果更明显，并可增强 5-Aza 的诱导效果。 关键词： 肝细胞生长因子；丹酚酸 B；骨髓间充质干细胞；心肌样细胞； The Effect on the Survival and Differentiation of MSCs Treated by Salvianolic Acid B and Ad-HGF Infection Abstract Objective To observe the effect on the survival, proliferation and capacity of anti-apoptosis under hypoxia environment of MSCs treated by salvianolic acid B and Ad-HGF infection; To investigate the effect on the differentiation of MSCs toward cardiac myocyte induced by salvianolic acid B and Ad-HGF infection. Methods MSCs were isolated and cultured by adherent culture method; After MSCs infected by Ad-HGF, the optimal multiplication of infection (MOI) was obtained through detecting the expression of green fluorescent protein (GFP) by flow cytometry, and the expression of target ge