微生物基因工程-生物科学与技术学院.pptVIP

动植物基因工程穿梭载体构建在大肠杆菌中完成外源基因或重组体DNA的拼接和改造。 大肠杆菌表达系统、酵母菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是采用重组细胞通过微生物发酵罐的方式大量生产目的蛋白。 基因工程也推动了微生物学的发展 对于新的微生物资源的开发，认识和了解微生物世界中更多的 微生物种类、微生物代谢、微生物遗传等将产生积极的影响。 8）带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中；（9）多克隆位点区的核着酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录负链DNA。（10）可以直接对克隆的DNA片段进行核苷酸序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤 （三）重组人干扰素生产 自从200多年前人们发现，预先接种过牛痘的人能够抵御天花感染的现象，并据此提出免疫的概念后，疫苗就已被广泛地用来预防多种传染病的传播。 转基因植物：是基因组中含有外源基因的植物。转基因植物的主要目的是提高用多肽或工业用酶的产量，改善食品质量，提高农作物对虫害及病原体的抵抗力。运用转基因技术，改变植物的某些遗传特性，培育高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等的作物新品种。 应用规模：全球已有25个国家批准了24种转基因作物的商业化应用。以转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积，由1996年的2550万亩发展到2009年的20亿亩，14年间增长了79倍。美国是最大的种植国，其次是巴西。 作业 1 什么是基因突变，基因突变有哪些类型？综述基因突变在医药/食品工业中的研究应用进展。 2 微生物基因工程在环境保护中的作用？ 3 什么是绿色基因？绿色基因聚合在发酵工程中的应用现状。 重组DNA技术中常用的工具酶1 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3′末端 重组DNA技术中常用的工具酶2 工 具 酶 功 能 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等 反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 重组DNA技术中常用的工具酶3 工 具 酶 功 能 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 微生物与克隆载体 质粒克隆载体、 λ噬菌体克隆载体、 柯斯质粒载体、 M13噬菌体载体、 噬菌粒载体、真核生物的克隆载体、人工染色体 载体（vector) 指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。 克隆载体（cloning vector)扩增转运外源基因的载体。 概念 作为克隆载体的基本要求 1）能够进行独立自主复制 2）具有若干切割酶的单一切割位点 3）具有可供选择的遗传标记 4）具有安全性 载体类型： 质粒克隆载体 1）具有独立复制起点 2）具有较小的相对分子量（103— 2X105pb) 3)具有较高拷贝数（紧密型质粒单拷贝，松弛型质粒多拷贝） 4）具有选择性标记 5）易于导入细胞 6）具有安全性（松弛型质粒不具有转移功能） 利用细菌的质粒，经人工改造而成 质粒克隆载体的特点 大肠杆菌载体pBR322结构特点 1）环状双链DNA分子，由4361pb组成 2）可插入分了量为5kpb的外源DNA 3）具有一个复制起点，是松弛型质粒 4）具四环素和氨苄青霉素抗性基因 5）具有插入失活现象 λ噬菌体克隆载体 ⑴λ-DNA可在体外包装成病毒颗粒，高效地感染大肠杆菌； ⑵可以把25Kb长的外源DNA 插入λ-DNA，引入受体细胞； ⑶重组λ-DNA的筛选和保藏较易 特点 噬菌体M13载体 1）从细菌中释放出来的噬菌体颗粒只含单链DNA，可用作为DNA测序的模板。 2）可用来产生单链的DNA探针，选择和分离互补的RNA。 3）M13的RF型是双链DNA，便于限制酶的识别和切割，克隆进双链的外源DNA。 4）插入M13的外源DNA超1000bp时就不稳定，在噬菌体增殖时会出现缺失。一般说，插入300～400bp是相当稳定的。 优点 柯斯质粒载体 由正常的质粒同噬菌体λ的cos位点构成 设计构建的柯斯质粒一般长4～6