SHP2酪氨酸磷酸酶SH2结构域的表达纯化和NMR研究.docVIP

浙江理工人学学报，第26卷，第4期,2009年 7 月 Journal of Zhejiang Sci-Tech University Vol .26，N o .4, Jul .2009 :1673-3851 (2009)04-0602-06 SHP-2酪氨酸磷酸酶C-SH2 结构域的表达纯化和NMR研究 李少飞，郭江峰，丁先锋 (浙江理工人学生命科学院,杭州310018) 摘耍:SH P-2足一种非跨脱型蛋0酪氨酸磷酸酶。将K N末端结构域C-SH2克隆至原核衣达载体pG EX-2T 屮，命名为pG EX-2T-C-SH2。该融合蛋內在人肠杆谢屮以可溶形式表达于谢体上淸液屮，经G ST亲和层析柱和FP LC分子筛柱纯化后，目的蛋A纯度可达98%。质谱分析表明，U的蛋A相对分子尕与理论值基本扣同。在敁适表达条 件下，1 L的M 9培养基能够高效表达并获得12 mg C-SH 2蛋白，NM R结构和活性位点的分析表明，目的蛋闩能 正确折呑并呈规则的空M结构。 关键词:SHP-2 ;C-SH2 :蛋白纯化洞位素标记;NMR ;H SQC 屮阁分类兮:Q 78 文献秘I只码:A 0引言 SH P-2属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员之一，作为细胞闪子、生biw子及真它胞外刺激W索的卜游倍号分子， 表达于机体的各种组织和细胞中，勾细胞塯殖、分化、转移、死亡等重要的生命活动密切相关［1_3］。SH P-2足 由PTPN11基因所编码的，真N末端前后含有两个SH 2结构域N-SH 2(3 —104)和C-SH 2(112 —216)，C末 端含有一个具有催化活性的PTP结构域(221 —524＞及富含脯氨酸基团和酪氨酸磷酸化位点的木端［4］。 H of等［41用X-射线研究了 SH P-2结构(1 一527)，但仍有部分肽段结构尚未解析出来，也括156 — 160、236 —245、295 —301 和 313 —323。Ugochukw u 等［5】M样用 X-射线研究了易受影响的 SH P-2结构(237 — 529),295 —301结构解析出來，但足236 —245和313 —323结构还是受影响。X-肘线 不容易测定一些松动结构区域的三维结构，促是用NM R可以在较短的时间内把易受影响的结构区域解 析出来［^。以前研究重点足N-SH2，近年來发现C-SH2可能发挥重要作川。 C-SH2在A身未磷酸化的怙况下，可能募集SH P-2到细胞表而受体［4 ’ 8］。C-SH2可能通过C末端的66个 氨基酸來调控PT P结构域。C-SH 2可能慕集SH P-2聚粜在磷酸化配体周围，増人N-SH 2与磷酸化配体的 结合机会，使蛋白构象变化并激活该酶［9］。C-SH2增强了信号转导过程的专-?性和特异性［9_WI ? 大量的研究表明，SH P-2屮C-SH 2结构域突变后，磷酸化酪氨酸残基pY不能与其结合，从而不能暴 露出PTP结构域的活性催化位点，抑制该酶活性并肌碍信兮转导级联反应，但对于其生物学作用及多种致病 机制仍需作更深入丫解。SH 2突变与Noonan综合征［1V12］,急性白血痫［13141，胃癌1 15161，肺腺瘤，黑素瘤 等疾病的关系还不明确，使其难以应用于临床诊断和治疗。因此，对SH2的结构和功能的研究具有重要意 义。本研究将C-S H2 H的基因插入到PGEX-2T表达载体，表达出GST融合蛋白，通过GS T亲和层析 柱纯化后，用NMR对C-SH2蛋门进行初步结构分析，为进一步研究其结构和功能;奠定基础。 收稿 H 期:2009 -01 -07 :李少飞(1983 -),男，山东烟台人，硕士研究生，主耍从事分子生物学研究。 ? 1994-2015 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. Iittp://w 1材料和方法 1.1材料 S HP-2全基因序列质粒和15 N HU CI山美W休斯顿大学髙晓莲教授提供，原核表达载体PGEX-2T及宿 主菌E .coli BL21(DE3)力木实验室提供，限制性内切酶EcoR I和B amH l(New England Biolabs产品)， PCR产物纯化试剂盒(A xygen公司产品)，蛋A定fi试剂盒(江苏碧云天生物科技公司产品)，GS T亲和层析 柱(GenScript产品)，凝血酶(Sigma产品)，Sephadex 75 HP填料(北京韦氏博慧色i普科技竹限公司产品)， 其他常规试剂均为进U分装或国产分析纯。 1 .2熏组质粒pGEX-2T-C-SH 2的构建 1 .2.1引物设计 根据SH P-2伞长DNA汴列(GenBank号:L03535),设计合成特异的上游引