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一、 实验目的和要求 学＞]SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的基本原理和操作方法。 蔗糖酶分离纯化产物的SDS检测分析。 学习测定蛋ITJ质和对分子质量(Mr)的方法。 二、 实验内容和原理 电泳是带电颗粒在电场作用卜\作定向运动即向着与其电荷相反的电极移动的现象。 电泳法分离、检测蛋A质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以 及所带净电荷多少等因素所产生的电泳迁移率的差别。 区带电泳：是样品物质在一惰性支持物上进行电泳，因电泳后，样品不同组分形成带 状区间，故称区带电泳。 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel,简称PAG)是由丙烯酰胺(Acr)和交联试 剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在冇引发剂(如过硫酸铵或核黄素)和增速剂(如 W -甲叉双丙傳概胺-四甲基乙二胺，TEMED) W -甲叉双丙傳概胺 CH2 - CH CH2 - CH C - 0 C - 0 1 1 nh2 NH 卜 NH 1 C ? 0 醐胺 1 CH2 . CH 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是在恒定的、非解离的缓冲系统中来分离蛋內质，这主 要是由蛋白质样品所带的电荷和分子质量的差异性进行分离；在电泳过程屮仍保持蛋白质 的天然构象、亚基之问的和互作用及其生物活性。 6、 聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为： ⑴连续系统：凝胶缓冲液的pH值及凝胶浓度不变。该电泳系统具宥电荷效应、分子筛 效应； ⑵不连续系统：凝胶缓冲离子成分、Pn值、凝胶浓度、电位梯度不连续，由浓缩胶和 分离胶组成。屮于浓缩胶的堆积（浓缩）作用，可使样品（即使是稀释样品）在浓缩胶和 分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。 该电泳系统具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。 SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 以PAG为支持物的电泳，由于各种蛋白质所带静电荷、分子量大小和形状不同而宥不 同的迁移率。为消除静电荷对迁移率的影响，在整个电泳体系中加入一定量的阴离子去污 剂“十二烷基硫酸钠（简称SDS） ”和“强还原剂（巯基乙醇）”后，蛋白质样品就会与 SDS结合形成带负电荷复合物,而SDS作为一种变性剂和助溶剂，它能破坏蛋0质分子内 和分子间的非共价键，并结合到蛋白质分子上，使分子去折叠，破坏蛋白质分子内的二级 和三级结构，使蛋0质变性而改变原宥的空问构象。另外，SDS—蛋0质复合物在强还原剂 （巯基乙醇）存在下，可打开蛋白质分子内或肽链间的二硫键，并能避免重新氧化，这样 分离出的谱带即为蛋U质亚基。蛋0质亚基的电泳的迁移率主要取决于亚基的和对分子质 景大小，而电荷的因素可以忽略。 蛋白质亚基相对分子质量的测方法 在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS吋，蛋白质一SDS复合物在水溶液中的 形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm,而K轴则随蛋0质的分子量成正比变化。这样的蛋0质-SDS复合物在凝胶中的迁 移率，不再受蛋白质原冇电荷和形状的影响，仙只主耍取决于它的椭圆棒的长度即蛋白质 的相对分子质量的大小，而其他因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。由于蛋白质 的相对分子质量不同，所形成复合物的相对分子质量不同，在电泳中反映出不同的迁移率。 当蛋白质或亚基的相对分子质量在15, 000?200, 000之间吋，电泳迁移率与相对分子质量 的对数呈直线关系，符合下列方程式： lgMr=K —bRf 式中Mr代表相对分子质量，K代表常数，b代表斜率，Rf代表迁移率。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。 米知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得蛋白质相 对分子质量。 三、实验材料和试剂 实验材料： 蔗糖酶样品(样品I、II、III、IV) 实验试剂： 30. 8%凝胶贮液:丙烯酰胺(Acr) 30g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0. 8g,加水溶解，并 加水定容到100ml，过滤。贮于棕色瓶，可在4°C保存一个月。丙烯酰胺和中叉双丙烯酰胺 单体及溶液是中枢神经毒物，耍小心操作。 分离胶缓冲液:3mol/L Tris-HCl pH8. 9 浓缩胶缓冲液:0. 5mol/L Tris-HCl pH6. 7 10% SDS TEMED(N，N，N，N 一四甲基乙二胺)(增速剂) 10%过硫酸铵(引发剂) 电泳缓冲液(pH8.3) : Tris6g,甘氨酸28. 8g, SDS 2g,用蒸馏水溶解并定至 1000ml,使用时稀释1倍。 蛋白质样品溶解液(2X蛋白质样品溶解液)： 内含1%SDS, 1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0. 01mol/L Tris-HCl pH8. 0 缓冲液。 染色液:0.25g