百里醌(TQ)抑制兔角膜新生血管的实验-研究.pdf

山两医科人学坝lj学位论史 令VEGF引物(上海生工生物科技有限公司) ◇FastStartUniversal SYBRGreenMaster fromRoche fROX)(Available Applied Science，瑞士罗氏制药) 1．3实验过程使用的主要仪器： 冷生物组织包埋机(金华市科迪仪器设备有限公司型号KD—BM) ◇组织切片机(金华市科迪仪器设备有限公司型号KD2258) 冷光学显微镜(OLYMPUS BX51，日本) 夺电子分析天平(sartorius) ◇恒温磁力搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司型号85．2) ◇电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司型号DNP一9802) 2．实验方法 2．1实验分组： 健康新西兰大白兔45只，按随机数字表法分组，(1)A组作为正常对照组 作为实验对照组，使用0．8％TWEEN20滴眼，它对角膜无任何作用。实验动物 的使用和处理遵循国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。 2．2建立角膜碱烧伤动物模型 建模前3天给兔眼点0．5％左氧氟沙星滴眼液4次／只，预防感染。术前用 309／L戊巴比妥钠(30mg／kg)耳缘静脉注射全身麻醉，用盐酸丙美卡因滴眼液 表面麻醉，将直径5．0mm的圆形单层滤纸片在1mol／L氢氧化钠溶液中浸泡达饱 和状态，置于兔角膜中央15s后，用生理盐水冲洗角膜及结膜囊1min，形成边 缘清楚的圆盘状白色烧灼区【51。根据Hughes分度法确定为中度碱烧伤‘61。烧伤 后即开始用0．8％Tween20配置好的三种不同浓度的TQ滴眼液点眼：B组点用 照组证明本实验碱烧伤的程度可以诱导出CNV，每日四次。各组均点0，5％左氧 氟沙星滴眼液，每同四次，使用一周预防感染。 2．3样本制各 各组兔子于碱烧伤后第28天，全身麻醉后以空气栓塞法处死，在无菌条件 下操作，取带有lmm宽巩膜的角膜组织，1／2置于10％中性甲醛中固定，石蜡 万方数据 山弧医科大学硕I：学位论文 u 包埋，垂直于角膜表面连续切片，厚约5 m，铺片行HE染色及免疫组织化学 法检测。另1／2的角膜组织行RT-PCR检测。 3．实验内容 3．1角膜新生血管的长度及面积测算 自建模24h后每日使用裂隙灯显微镜观察CNV的发生情况，至各组出现 并照相(裂隙灯下10倍)。测量CNV时以连续弯曲度小，向心性生长的最长血 管为标准。运用公式计算新生血管的生长面积，S=C／12x3．11416×『r2．(r— 1)21，s为角膜新生血管的生长面积，C为角膜新生血管网的跨圆周钟点数，1为 新生血管从角膜缘伸入角膜的长度，r为角膜半径。 3．2免疫组织化学法检测VEGF的表达 (1)60℃烤片2小时； (2)石蜡脱蜡。二甲苯I、II中各15分钟； 5分钟； (4)PBS溶液洗三次，每次5分钟； (5)抗原修复。将载玻片放入枸橼酸缓冲液中，行沸水浴抗原修复15分钟(约 92—95。C)，自然凉至室温。PBS溶液洗三次，每次5分钟； (6)3％过氧化氢去离子水封闭20分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。PBS 溶液洗三次，每次5分钟； (7)滴加正常山羊血清工作液封闭，37℃下孵育20分钟倾去； (8)滴加稀释后的一抗(比例l：100)，4℃过夜； (9)第二天复温20分钟，PBS溶液洗三次，每次5分钟； 三次，每次5分钟； (11)三抗孵育，37℃20分钟(三抗为辣根酶标记的链酶亲和素工作液 S．～HRP)，PBS溶液洗三次，每次5分钟； (12)滴加DAB显色液，镜下观察结果