《1氨基酸(柯)》精选课件.pptVIP

* 55％ 24％ 植物生理生化实验 目的要求： 1、了解植物体内氨基酸测定的意义； 2、了解氨基酸测定的方法； 3、掌握茚三酮法测定测定游离氨基酸总量的基本原 理及其操作要点; 4、进一步熟练722S型分光光度计的使用方法。 实验一 植物组织中氨基酸总量的测定 (茚三酮试剂显色法) 植物生理生化实验 测定意义： 实验一 植物组织中氨基酸总量的测定 (茚三酮试剂显色法) 氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输。所以测定植物组织中不同时期、不同部位游离氨基酸的含量，对于研究根系生理、氮素代谢等有一定意义 。 55％ 21％ 24％ 植物生理生化实验 测定方法： 1、氨基酸自动分析仪 2、高效液相色谱法 3、甲醛滴定法 4、纸层析法 5、薄层层析法 6、茚三酮试剂显色法√ 55％ 植物生理生化实验 测定方法： 1、氨基酸自动分析仪 蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。 Biochrom 30 专用自动氨基酸分析系统（英国） 植物生理生化实验 测定方法： 2、高效液相色谱法 LC98ⅡRI系列高效液相色谱仪 ?????????????????????????????????????????????????????????????????? LC600高效液相色谱仪 24％ 植物生理生化实验 测定方法： 3、甲醛滴定法： 氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基显示酸性，又含有-NH2基显示碱性。由于这二个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量. 24％ 植物生理生化实验 测定方法： 4、纸层析法 纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后其一物质在纸层析谱上的位置常用比移值Rf来表示。 24％ 植物生理生化实验 原理： 当氨基酸与水合茚三酮共热时，能产生二酮茚—二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，在一定范围内，其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比。据此，可用分光光度计，在波长570nm下，测定反应产物的消光值。根据标准曲线计算出未知样品中氨基酸的总量。氨基酸与茚三酮的反应分为两步进行： 第一步：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被还原 成还原型茚三酮； 第二步：所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和氨 缩合生成Ruhemans紫。 6、茚三酮试剂显色法√ 植物生理生化实验 仪器设备： 722S分光光度计； 电子天平； 恒温水浴； 容量瓶； 研钵；移液管；20ml具塞刻度试管; 普通试管；三角瓶；漏斗等。 24％ 植物生理生化实验 试剂配制： 1.水合茚三酮试剂∶取0.6g茚三酮置于烧杯中，加15ml正丙醇，令其溶解，再加30mL正丁醇及60mL乙二醇，最后加入9mL pH5.4的0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶，置于4℃下保存备用，10天内有效。 2.乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4):称取乙酸钠54.4克，加入100mL无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸，再用无氨蒸馏水稀释至100mL。 3. 标准亮氨酸∶取亮氨酸46.8mg，溶于10%异丙醇溶液中，并用10%异丙醇定容为100mL(10%异丙醇应以pH5.4, 0.2M醋酸盐缓冲液做溶剂配制)。取此5mL液，再用pH5.4醋酸盐缓冲液定容到50mL,此即为含氮为5ug/mL的标准液。 4.0.1%抗坏血酸溶液：称取50mg抗坏血酸，溶于50mL无氨蒸馏水中，随用随配。 植物生理生化实验 经不同浓度NaCl处理的萌发水稻种子 植物材料： 植物生理生化实验 操作步骤 1．样品提取： 称取新鲜的植物材料1.0g，加5mL10%醋酸研 磨匀浆，用少量多次的无氨水洗入100ml容量瓶，定容至刻度，摇匀，过滤入干燥的三角瓶中，