常见的流式细胞仪分析技术及应用.pptVIP

流式细胞术（flow cytometry ，FCM）是以流式细胞仪作为检测工具，结合激光光学、计算机、电子物理学、流体力学、细胞化学和免疫学等学科的理论与技术，对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 流动室——仪器的核心部件，待测样品与激光在这里相交，通常由有机玻璃、光学玻璃或石英等制成。 流动室内充满了鞘液，使细胞排成单列进入流动室喷嘴口，形成细胞液柱。 液流驱动系统：包括压缩空气泵、压力传感器、鞘液过滤器和样本压力调节器等。 常用的液流系统中细胞流和鞘液流的驱动一般采用正压的方法控制的，保证了鞘液的流速恒定。 鞘液以匀速通过流动室，因此整个液流系统运行流速是不变的。 光学系统：主要由多组透镜、滤光片和分光镜等光学元件组成，将不同波长的光信号送入不同的探测器 当单细胞悬液形成液柱通过流动室时，液柱被分割成一连串均匀的液滴。 根据设定的被分选细胞的某个参数由逻辑电路判断是否被分选。 充电电路对选定细胞液滴充电，使其带正电荷或负电荷，未被设定分选参数的细胞液滴则不带电荷。 带电细胞液滴通过静电场而发生偏转，落入收集器中，其他液体则被当作废液抽吸掉，完成细胞分选的目的。 每秒可分离所要细胞的个数，一般要求分选速度至少达5000个/秒左右。 第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、散射光的测定 三、荧光测量 当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。 特异性荧光探针与单克隆抗体结合后，与细胞膜或细胞内的靶抗原结合，经染色后的细胞在激光的照射下，荧光染料发出比激发光波长长的荧光，检测荧光素信号的强弱就可以了解抗原表达量的多少。 （一）荧光信号测量与放大器 线性放大器：输入与输出放大倍数相同，用于信号强度变化较小或具有生物学线性的信号 对数放大器：输入放大10倍，输出由1变为2，用于信号强度变化较大且其光谱信号较复杂的信号 （二）荧光补偿 消除重叠信号 四、数据显示方式 Y轴代表颗粒计数（Count），反映相同荧光或散射光强度的颗粒相对数量的多少，可用于定性、定量资料的分析。 双参数直方图是一种细胞与双测量参数的图形，X轴与Y轴分别代表一种参数。 双参数信号常采用对数信号，最常用的基本表示法是用点密图来显示。 如果把一个散点图分别投影到X轴和Y轴，可得到两个单参数直方图。 临床实践中常以多个散点图联合分析。 点图由二维参数构成，根据颗粒密度来反映相同光信号的颗粒数量的多少 把代表相同细胞数目的点依次连接起来形成密闭曲线，越在里面的曲线代表的细胞数目越多，越密集的区域也就是细胞数目变化最快的区间。 三维坐标均为参数（散射光或荧光）而非细胞数 对复杂的细胞亚群观察更为直观、准确，但对其数据的统计分析较难 FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术能够无法显示四维空间结构。 随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以获得所需的信息。 多参数分析能够同时比较各种细胞的不同抗原表达水平，可以统计出多种数据。 指同一张单参数或双参数直方图中根据信号的强弱来划定分析区域，从而计算分析区域内的细胞数量。 流式细胞仪的应用已从科研进入了临床，在进行科研和临床检验定量分析过程中，应明确各项工作环节的影响因素并对仪器性能进行严格的质量控制，以保证检测数据的准确性和可靠性。 确保标本上机检测前细胞浓度满足仪器检测要求。 荧光抗体染色后需充分洗涤，注意混匀、低速离心，减少重叠细胞和细胞碎片。 避光染色，保证细胞免疫荧光的稳定。 必须根据具体实验目的设置必要的对照，确保实验结果的准确性和客观性，消除非特异性荧光的影响。 判定结果时，应注意减去本底荧光，可应用计算机程序软件，使定量分析更精确。 能否制备出合格的单细胞悬液是关系最终分析结果准确与否的关键。 单细胞悬液大多来自生物样品，不同组织来源的样本制备方法也不同。 流式细胞术主要是以某一类细胞群为检测对象，减少检测时的干扰因素。 新鲜的外周血是天然的单细胞悬液。 单次密度梯度离心法是最常用于分离制备单个核细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离外周血中的单个核细胞。 培养细胞一般是以悬浮或贴壁的方式生长。 将新鲜实体组织进行单细胞悬液的制备是一项困难而复杂的技术。理想的状态是既要达到分离细胞的目的又要不损伤细胞。 最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法和表面活性剂处理法等。 不论是哪种方法都不可避免的会对细胞表面膜结构、细胞活性和功能等造成不同程度的损伤。 该制备方法