二甲双胍抑制肾癌生长及其分子机制研究-外科学(泌尿外科)专业论文.docxVIP

二甲双胍抑制肾癌生长及其分子机制研究 博士研究生：刘 俊 导 师：胡卫列 教授 宋 波 教授 摘 要 研究背景 肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC），简称为肾癌，占肾脏恶性肿瘤的 80％～90 ％，是泌尿系统常见肿瘤之一，约占成人恶性肿瘤的 2％～3％，全球每年新发病例大 概有 210000。在泌尿系所有的肿瘤中，肾癌危害最大，流行病学资料显示，超过 40% 的肾癌患者死于该病，全球每年死于肾癌的人数约有 100000。 外科手术是根治肾癌的主要方法。局限性肾癌患者接受根治性肾切除术或保留肾 单位手术后，大约 90%以上的患者能够获得 5 年无病生存。然而约 1/3 的肾癌患者在 初次就诊时就已发现有转移，无法接受根治性手术治疗，另外局限性肾癌患者行根治 性手术后仍有大约 20%～30%的复发和转移率。转移性肾癌（metastatic renal cell carcinoma, mRCC）的预后非常差，中位生存期只有 6～12 个月，5 年生存率小于 10%。 因此，转移性肾癌的治疗仍是临床面临的一项重大挑战。 肾癌对传统的放化疗均不敏感。基于肾癌的免疫原性，以 IFN- a 和 IL-2 为代表的 细胞因子和免疫治疗，能够改善部分患者的临床症状，然而不能显著改善患者的无进 展生存时间和总生存时间，总体有效率不到 20%，并且有严重的副作用，只有少部分 患者能够耐受治疗。鉴于此，需要探索 mRCC 新的治疗手段。 以酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼（Sorafenib）为代表的肾癌分子靶向治疗药物的出 现，开创了 mRCC 治疗的新时代。目前临床上肾癌分子靶向治疗药物主要分为两类， VEGF 信号通路（血管生成信号通路）抑制剂和 mTOR 信号通路抑制剂。上述靶向治 疗药物能够显著提高患者的无进展生存时间和总生存时间，副作用较免疫治疗轻微。 然而其仍然面临许多挑战：首先，治疗有效率仍较低，只有大约 10％～40％，与干扰 素相比，其生存优势只有 6 个月；其次，随着治疗的进行，绝大多数患者最后都会发 展成对靶向治疗药物产生抗药性；最后，靶向治疗药物花费昂贵，只有极少的一部分 患者能够承担并接受这些治疗。因此有必要探索并寻找新的治疗靶点和药物，为 mRCC 的治疗提供更多的选择。 二甲双胍（Metformin）是临床上广泛使用的一种双胍类降糖药物，主要用途是用 于治疗 2 型糖尿病。最近的研究发现，使用二甲双胍的糖尿病患者，其患前列腺癌、 乳腺癌、肝癌等肿瘤的风险降低，并且肿瘤相关死亡率也降低。同时实验研究发现， 二甲双胍能够抑制体外培养的前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、黑色素瘤细 胞的增殖，并且体内实验证实二甲双胍能够抑制上述肿瘤的生长。上述研究提示二甲 双胍对肿瘤的防治可能有意义。但目前还没有关于二甲双胍对肾癌生长影响的研究报 道。二甲双胍对肾癌细胞的增殖、迁移以及死亡是否有影响，二甲双胍能否抑制肾癌 瘤块的生长，目前尚不清楚。此外二甲双胍抑制肿瘤生长的机制也不清楚，是否与其 降低血糖、对代谢的影响有关，以及具体通过什么分子机制、信号途径来实现对肿瘤 生长的抑制都还需要深入细致的研究。鉴于目前转移性肾癌治疗所面临的困难局面， 二甲双胍作为一种廉价、安全的治疗药物，研究其对肾癌生长的可能影响，将是非常 有意义的研究工作，其结果将对转移性肾癌的临床治疗起到有意义的借鉴。 研究目的 本研究将以体外培养的肾癌细胞及肾癌移植瘤为研究模型，通过体外实验及体内 实验探讨二甲双胍对肾癌生长的影响，并从分子水平探讨二甲双胍引起上述影响的可 能机制。希望通过以上研究，明确二甲双胍对肾癌生长的影响，并且初步探讨其机制， 为二甲双胍的抗肿瘤效应提供新的证据，为转移性肾癌的临床治疗提供新的思路和治 疗选择。 方法 一、体外细胞实验：采用 MTT 法检测不同浓度的二甲双胍对肾癌细胞 786-O、 OS-RC-2 增殖以及生长曲线的影响；检测不同浓度的二甲双胍对 786-O、OS-RC-2 细 胞克隆形成的影响；利用划痕愈合实验来检测二甲双胍对 786-O、OS-RC-2 细胞迁移 能力的影响；采用 Annexin V-FITC/PI 染色，分别在荧光显微镜下观察及流式细胞仪分 析来检测二甲双胍对肾癌细胞死亡的影响。 二、体内动物实验：构建肾癌细胞的裸鼠移植瘤模型，检测二甲双胍对肾癌移植 瘤生长的影响。 三、机制初步探讨：利用流式细胞仪检测分析二甲双胍对肾癌细胞周期进行的影 响；利用免疫印迹法及荧光实时定量 RT-PCR 等技术研究二甲双胍对细胞周期调控蛋 白、AMPK 信号通路、mTORC1 信号通路、mTORC2 信号通路及肿瘤侵袭相关基因的 影响，探讨二甲双胍抑制肾癌细胞生长、迁移及促进其死亡的分子机制。 结果 一、二