多氯联苯与苯并芘联合作用对机体损伤修复及遗传稳定的影响研究-劳动卫生与环境卫生专业论文.docxVIP

华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 多氯联苯与苯并芘联合作用对机体损伤修复及遗传稳定的 影响研究 博士生：魏巍 导 师：鲁文清 教授 华中科技大学同济医学院公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系 教育部环境与健康重点实验室 摘 要 多氯联苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）与苯并(a)芘（benzo(a)pyrene， BaP）作为两种重要的污染物，因其在环境中广泛存在并可对人体造成包括致癌、 致突变在内的多种有害效应而备受关注。现有的研究证实，PCBs 在体内可有效 的促进 BaP 的代谢活化，诱导后者转化生成其终致癌物，从而在联合作用时显 著增强 BaP 的遗传毒性效应。由于上述遗传毒性终点效应发生在机体中往往要 经过数十年的时间，且二者在环境中浓度较低，因此目前经毒理学研究发现的 PCBs 与 BaP 的有害效应在普通人群中得到证实的报道极为少见。鉴于以上原因， 探寻机体接触 PCBs 与 BaP 后产生的早期应答事件，对于评价和预测这两种重要 环境污染物暴露所导致的健康危害意义重大。 目的： 各种环境有害因素经过不同途径作用于人体，在绝大多数情况下都会直接或 间接地引起相应基因的表达发生变化。和传统的毒理学指标相比，针对毒性相关 的基因表达变化的研究能更敏感的反映环境因素的毒性特征。本研究拟以基因表 达谱芯片技术探讨在 PCBs 与 BaP 联合作用下重要基因功能通路的表达变化，以 期发现对二者联合暴露有重要意义的早期应答基因。并以此为线索，对涉及 DNA 损伤修复、细胞周期以及凋亡状态的部分重要功能通路进行深入的研究，从分子 水平上揭示 PCBs 与 BaP 联合作用的毒性作用机制，最终为二者联合暴露所致健 康危害的早期评价提供实验依据。 方法： 本文以 HepG2 细胞为靶细胞，选择 PCBs 的代表性同系物 PCB126 与 PCB153 为研究对象，设 PCB126 剂量为 1nmol/L，PCB153 剂量为 10μmol/L，BaP 剂量 为 50μmol/L，以 10 ml/L 二甲基亚砜（DMSO）为溶剂对照组，进行各物质的单 独染毒。同时以 PCB126、PCB153 预处理 HepG2 细胞 48 小时后，再与 BaP 联 合染毒 24 小时。通过表达谱芯片技术检测染毒后细胞相关功能基因的表达变化； 根据芯片结果的提示，选择 PCB126 为 PCBs 受试物，设 PCB126 四个剂量组（0.01、 0.1、1、10nmol/L）、BaP 一个剂量组（50μmol/L），以 DNA 损伤修复功能、细 胞周期及凋亡状态的变化为研究重点，探讨二者联合作用对重要功能通路的影 响。以蛋白质免疫印迹技术检测染毒后细胞核苷酸切除修复通路上关键修复因子 XPA、XPB、XPC 的蛋白表达变化，同时引入 BaP 代谢活化抑制剂 ANF，在降 低 PCB126 与 BaP 二者所导致的遗传损伤后，进一步探讨联合作用时 DNA 损伤 程度与修复通路功能状态的联系；以流式细胞术检测染毒后细胞周期及凋亡状态 的变化，借此寻找 PCB 与 BaP 联合暴露的早期效应。为更深入认识二者联合暴 露的毒作用终点和毒作用机制，以 RNA 干扰技术建立芳烃受体低表达的细胞株， 为后期研究芳烃受体在二者联合毒作用中所发挥的关键作用提供技术支撑。 结果： BaP 单独作用时主要诱导 DNA 损伤修复基因、细胞周期以及凋亡调控相关 基因的表达发生变化，上述功能通路基因的表达变化总体上将有利于细胞维持自 身的遗传稳定。PCB126 与 PCB153 单独作用时可有效的诱导代谢酶相关基因的 表达，且 PCB126 的诱导效应明显强于 PCB153。PCBs 与 BaP 联合作用后对 DNA 损伤修复基因、周期以及凋亡调控基因的表达可产生复杂的不良影响，其诱导模 式与 BaP 单独作用相比有较大的区别。 PCB126 和 BaP 单独作用均能有效的诱导修复因子 XPA 的表达上调，与溶 剂对照比较，差异有显著性（P＜0.01）。与 BaP 单独作用相比，除最低剂量以外， PCB126 和 BaP 联合作用可明显抑制修复因子 XPA 的蛋白表达（P＜0.01）。加入 抑制剂 ANF 后，除 PCB126 最高剂量与 BaP 联合作用可显著抑制 XPA 的表达外 （P＜0.05），其余所有剂量组的 XPA 表达量均恢复至溶剂对照 DMSO 所诱导的 水平。 BaP 单独作用可有效的抑制修复因子 XPB 的表达，与溶剂对照比较，差异 有显著性（P＜0.01）；PCB126 单独作用可有效诱导修复因子 XPB 的表达量升高， 在浓度为 1nm