产乙偶姻枯草芽孢杆菌代谢工程改造的初步研究-生物化工专业论文.docxVIP

摘 要 乙偶姻是一种重要的平台化合物，广泛应用于食品和其它行业。本文围绕乙 偶姻生物合成反应，以野生型 Bacillus subtilis 168 为出发菌株对枯草芽孢杆菌进 行了代谢工程改造，旨在利用代谢工程方法提高枯草芽孢杆菌生产乙偶姻的得率 和产量。通过在枯草芽孢杆菌中敲除 bdhA 和 acoA 基因，过表达 alsSD 操纵子， 敲除 pta 基因与 ldh 基因，以尽量减少自身的降解以及副产物的生成与积累，从 而提高乙偶姻的生物合成。 本课题采用构建双交换整合型敲除与双交换整合型过表达质粒的方法，在 B. subtilis168 中敲除了 bdhA 和 acoA 基因，得到单敲除菌和二者的双敲除菌株 BSUW03。在摇瓶微氧发酵条件下，bdhA 突变株的 2,3-丁二醇生成在稳定期早期 即得到阻断，使得其前体物质乙偶姻过量积累，且该菌株的乙偶姻得率比野生型 提高了 10%。acoA 敲除株中乙偶姻几乎不会降解，从而增加乙偶姻的积累。 BSUW03 能够得到 0.72 mol/mol 的乙偶姻得率，较 B. subtilis168 提高了 16.4%。 通过构建淀粉酶位点整合型载体 pDKW，转化得到过表达 alsSD 操纵子的菌 株 BSUW05。在对数期和稳定期，过表达 alsSD 分别将乙酰乳酸合成酶活性提高 了 52%和 66%，且 alsSD 得到过表达菌株的乙偶姻得率达到 0.78 mol/mol。然后， 构建了 pta 敲除型质粒，进一步敲除 pta，却发现该基因敲除对于乙偶姻产量的 影响较小，然而经过摇瓶发酵比较各菌种的乙偶姻生产性能，仍表明 pta 敲除后 的工程菌 BSUW06 乙偶姻生产性能最好。 为了提高工程菌的乙偶姻生产率，对于高糖浓度摇瓶发酵，尝试了不同培养 基和溶氧条件。工程菌 BSUW06 的乙偶姻生产率，可以由在 M9 培养基加 30 g/L 葡萄糖和微氧条件时的 0.087 g/(L·h)-1，提高到最后选用 LB 培养基加 50 g/L 葡萄 糖和有氧条件时的 0.273 g/(L·h)-1，而且这种条件下乙偶姻得率降低不明显。最 后，对 BSUW06 和 B. subtilis168 在发酵罐中利用相对好氧的条件进行了批式培 养，BSUW06 能够得到比 B. subtilis168 提高 39.4%的乙偶姻产量（19.8 g/L）。 以上研究表明，可以通过代谢过程方法来实现乙偶姻产量的大幅度提高，也为其 它相关工作提供了一些代谢工程借鉴。 关键词： 乙偶姻 枯草芽孢杆菌 代谢工程 得率 生产率 ABSTRACT Acetoin is an important platform compound, widely used in food and other industries. Focusing on the acetoin biosynthetic reactions, Bacillus subtilis 168 was engineered as the starting strain, aiming at enhancing the acetoin yield and productivity with Bacillus subtilis by metabolic engineering. The bdhA and acoA genes were disrupted, the alsSD operon was overexpressed, and the pta and ldh genes were deleted, to increase the acetoin biosynthis and reduce the accumulation of its competing compounds. Applying the approaches of constructing the double-crossover knock-out plasmid and double-crossover overexpressing plasmid, the bdhA and acoA genes were inactiviated in B. subtilis 168 to obtain the strains with single disruption of bdhA or acoA and the strain BSUWO3 with disruption of both genes. Under the mirco-aerobic flask fermentations, for the bdhA-disrupted mutant, 2,3-butanediol prod