ELISPOT技术应用简介课件.pptx

MABTECH ELISpot技术 应用简介任东莱兹技术部主要内容ELISpot原理、优势及应用具体操作步骤常见问题总结技术的改进参考文献Mabtech 公司是世界首家研发和生产ELISpot 试剂盒的公司，为广大科研和临床用户提供稳定的高质量的产品，包括人类、非人灵长类、大鼠、小鼠等种属的T淋巴细胞因子和B细胞分泌抗体检测产品，其中非人灵长类试剂盒是科研人员首选之品。原理 酶联免疫斑点检测（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay, ELISpot），从字面上来说，可以分解成两部分：“酶联免疫”与“斑点”。 ELISAELISPOT酶联免疫 抗体捕获的抗原来自样品溶液中的已经存在的、均匀分布的抗原分子 抗体捕获的抗原来自于样品细胞在检测的当时新鲜分泌的抗原分子斑点 显色出来的是或深或浅的有色溶液 显色出来的是沉积在固体基板上或多或少的有色斑点 一言以蔽之，ELISA 检测的是无生命的溶液中抗原分子的浓度，ELISpot 检测的是有生物活性的活细胞分泌抗原的功能。A.特异性单抗包被在培养孔底部； B.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞开始分泌细胞因子，细胞因子就近被包被抗体捕获；C.移出细胞，板底留下自胞因子的潜在“影像”；D.加入酶标记的检测抗体，检测抗体和“影像”上的细胞因子结合，形成“抗体-抗原-抗体”夹心结构； E.加入显色底物，在酶的催化分解下，生成不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；F.斑点计数（可人工计数，也可用自动读板仪计数），数据处理，结果分析。斑点的特征圆型，有晕核结构 大小不均一，成正态分布◆ 悬浮在ELISpot板膜上的细胞，它分泌细胞因子是没有方向性的，均匀地向四面八方扩散，其中路径越短，扩散中耗散损失就越少，到达该点的细胞因子就越多，将来显色的时候颜色就越深。◆不同的细胞，对不同的刺激物，不同的细胞因子，ELISpot斑点的直径（平均直径）也不同，如果一次实验中有两类细胞同时受到刺激，比如T 细胞与巨噬细胞，或者一次实验中T 细胞受到两种不同的刺激物刺激，比如蛋白抗原与内毒素（大肠杆菌表达的蛋白很可能含有较高浓度的内毒素），那么同一个孔中就会出现两种不同的斑点。ELISPOT的优势高通量检测灵敏度高功能性检测单细胞水平只要阳性细胞频率大于4 个/60 万细胞，就可以被ELISpot检测出来。这算出来的实际灵敏度为十五万分之一。 直观，可信度高ELISpot 技术的应用领域移植中排斥反应的预测和监测。疫苗研发和机制研究。Th1/Th2极化的分析和研究。自身免疫病研究。肿瘤致病机制和治疗药物的研究和开发。变态反应性疾病等自身免疫病研究。感染性疾病的治疗和研究。抗原决定簇图谱分析。化合物和药物免疫学反应的筛选等。中国药品生物制品检定所： 2003年 《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》《预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指标原则》“使用ELISPOT方法检测淋巴细胞分泌γ干扰素功能，应该作为检测和评价疫苗的细胞免疫的有效方法” WHO：WHO-UNAIDS-sponsored training workshop 2003年 在艾滋病(HIV)疫苗的研究中，推荐使用ELISPOT检测淋巴细胞分泌γ干扰素功能。卫生部文件（【2012】6号）：增补结核感染T细胞检测（免疫斑点法）等临床检验项目。具体操作流程及常见问题◆ 操作流程演示◆ 常见问题小结1 PVDF膜酒精浸润2 PBS洗涤三次3加包被抗体过夜4 PBS洗涤三次5封闭，室温2小时6 PBS洗涤三次7加入细胞和刺激物孵育过夜8去除细胞，PBST4℃十分钟后洗涤三次9加检测抗体，室温孵育1.5小时10 PBST洗涤三次11 加SAP室温孵育1小时12 PBST洗涤三次13 加入 BCIP/NBT显色14 计数，结果分析第一天无菌操作预包被可以省去的步骤第二天无须无菌操作第三天操作流程及易出现的问题 ◆ 操作流程演示 ◆常见问题小结第一天，包被抗体第二天，分离PBMC，培养2000 rpm, 10min 离心分离血清，保存备用。 加淋巴细胞分离液后，最多可加两倍体积的全血。旋转的手法提取 吸取PBMC层细胞放入新的离心管中，加入2倍体积的PBS洗涤两次。离心之后的PBMC沉淀PBMC计数准备5%CO2 37℃培养箱培养＊适当浓度的抗原（10-50μg/ml）＊适当浓度的细胞悬液（2～5×105/孔）BCIP/NBT底物细胞因子单克隆抗体生物素化检测Ab抗生物素ALP室温下显色2-10分钟 室温避光过夜晾干之后，读板，或者晾干避光保存。操作流程及常见的问题 ◆操作流程演示◆ 常见问题小结1酒精预湿时要恰当 PVDF膜由于其疏水性，需要酒精预湿润，但是预湿的时间太长和太短都不合适。 一般情况下，预湿