食品中多种微生物检测方法 飞行质谱法 征求意见稿.docVIP

××/T ××××—×××× PAGE II PAGE 1 发布中 华 人 民 共 和 国国家质量监督检验检疫总局 ××××-××-××实施××××- 发布 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 ××××-××-××实施 ××××-××-××发布 食品中多种微生物检测方法 飞行质谱法 Detection of Pathogen in Food MALDI-TOF-MS Method SN/T ××××—×××× SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 ICS 备案号： SN/T ××××—×××× PAGE 3 前 言 本标准是根据GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》的要求进行编写的。 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准主要起草单位：辽宁出入境检验检疫局 本标准主要起草人：曹际娟 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 食品中多种微生物检测方法 飞行质谱法 范围 本标准规定了食品中沙门氏菌、单增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌的飞行质谱检测方法。 本标准适用于食品中沙门氏菌、单增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌的快速检测。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 4789.4 食品卫生微生物检验 沙门氏菌检验 GB/T 4789.7 食品卫生微生物检验 副溶血性弧菌检验 GB/T 4789.30 食品卫生微生物检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 SN/T 1022 出口食品中霍乱弧菌检验方法 SN/T 0184.1 进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法 缩略语 MALDI-TOF-MS：Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry，基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱。 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照GB 19489 实验室 生物安全通用要求中的有关规定执行。 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30 min后再弃置。 原理 MALDI-TOF-MS是应用于细菌全细胞快速检测的技术，主要依据存在于细菌表面的多个蛋白质的分子量信息，完成细菌的鉴定和分类。将样品与适量的基质溶液点加在样品板上，溶剂挥发后形成样品与基质的共结晶，利用激光作为能量来源辐射共结晶体，基质分子吸收能量与样品解吸附并使样品电离，经过飞行时间检测器，将不同质荷比的离子分开，形成细菌特异性的质谱图。 7 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯。 7.1 ddH2O：应符合GB/T 6682中一级水的规格。 7.2乙腈（Acetonitrile，ACN）。 7.3无水乙醇。 7.4甲酸（formic acid，FA）。 7.5三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA）。 7.6 α-氰-4-羟基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic，CHCA）。 7.7肽标准品（Peptide Calibration Standard）。 7.8蛋白标准品（Protein Calibration StandardⅠ）。 7.9基质溶液配制：将基质CHCA粉末加入到含有50%乙腈、2.5%三氟乙酸的水溶液中，配制成饱和溶液。 7.10 标准品溶液配制：将肽标准品干粉、蛋白标准品干粉分别溶于ACN /TFA/水的比例为30：0.1：69.9的溶液中，将肽溶液与蛋白溶液以1：5的比例混合后配制成标准品溶液。 8 主要仪器和设备 8.1基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MicroflexTM MALDI-TOF )。 8.2离心机（离心转速14800×g，730×g）。 8.3 微量可调移液器和灭菌吸头：2 μL，10 μL，100 μL，200 μL，1000 μL。 9 方法提要与检测程序 9.1 方法提要 本方法利用MALDI-TOF-MS技术，不同细菌显示特异性的质谱图，建立已知细菌的标准蛋白质组指纹质谱数据库，将待测细菌质谱图与已知细菌的标准蛋白质组指纹质谱数据库进行比较，可以确定细菌的种属，进行细菌鉴定，从而对食品