广西地方标准柑橘溃疡病菌PCR检测技术规程（征求意见稿）.docVIP

DB45/T ××××—2013 DB45/T ××××—2013 PAGE 6 PAGE I DB45广西壮族自治区质量技术监督局 发布2013-XX-XX实施2013-XX-XX发布柑橘溃疡病菌PCR检测技术规程Rule of Detection Method of PCR for Citrus Canker DB45 广西壮族自治区质量技术监督局 发布 2013-XX-XX实施 2013-XX-XX发布 柑橘溃疡病菌PCR检测技术规程 Rule of Detection Method of PCR for Citrus Canker （征求意见稿） DB45/T XXX—2013 广西壮族自治区地方标准 ICS B16 备案号 I 目 次 TOC \f \h \t 前言、引言标题,附录标识,参考文献、索引标题,章标题,附录章标题 HYPERLINK \l _Toc322902175 前 言 II HYPERLINK \l _Toc322902176 1 范围 PAGEREF _Toc322902176 \h 1 HYPERLINK \l _Toc322902177 2 缩略语和定义 PAGEREF _Toc322902177 \h 1 HYPERLINK \l _Toc322902178 3 原理 PAGEREF _Toc322902178 \h 1 HYPERLINK \l _Toc322902179 4 样品采集 PAGEREF _Toc322902179 \h 1 HYPERLINK \l _Toc322902180 5 柑橘溃疡病菌分子鉴定(PCR) PAGEREF _Toc322902180 \h 1 HYPERLINK \l _Toc322902181 6 结果判定 PAGEREF _Toc322902181 \h 3 HYPERLINK \l _Toc322902182 7 检测后样品的处理 PAGEREF _Toc322902182 \h 3 HYPERLINK \l _Toc322902183 附　录　A （资料性附录） 柑橘溃疡病症状特征 PAGEREF _Toc322902183 \h 4 HYPERLINK \l _Toc322902184 附　录　B （规范性附录） 试剂和溶液配制 PAGEREF _Toc322902184 \h 5 II 前 言 本标准的附录A是资料性附录，附录B是规范性附录。 本标准由广西壮族自治区农业厅提出。 本标准由广西壮族自治区柑桔研究所起草。 本标准主要起草人：邓崇岭，娄兵海，宋雅琴，王明召，陈国平，陈传武，唐艳，左明，邓光宙，周正华，付慧敏 本标准为首次发布。 PAGE 3 柑橘溃疡病菌PCR检测技术规程 范围 本标准规定了柑橘溃疡病菌实验室分子检验技术要求。 本标准适用于对芸香科植物感染柑橘溃疡病菌的检验、检测和鉴定。 缩略语和定义 下列缩略语和定义适用于本标准。 缩略语 bp： 碱基对 DNA：脱氧核糖核酸 PCR：聚合酶链式反应 Taq酶：Taq DNA聚合酶 EB：溴化乙锭 Tris：三羟甲基氨基甲烷 EDTA：乙二胺四乙酸 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵 PVP：聚乙烯吡咯烷酮 柑橘溃疡病 由柑橘溃疡病菌（Xanthomonas campestris pv. citri (Hasse) Dye）引起、主要通过苗木、接穗和果实远距离传播，有时带菌土壤亦能传病，是一种危害柑橘属、枳壳属和金柑属植物的重要病害。 原理 柑橘溃疡病，在鉴定时除了进行田间识别外，主要采取细菌DNA体外扩增的方式进行检测。根据柑橘溃疡病菌基因组序列设计一对特异性引物，在热稳定DNA聚合酶的作用下，合成大量目标DNA片段，最终通过凝胶电泳分离检测出特定大小的柑橘溃疡病菌特异性DNA谱带，根据该谱带的有无确定样品是否带有柑橘溃疡病菌。 样品采集 鉴定取样 采有典型和疑似症状（参见附录A）的植株叶片，树苗每株采5张叶片，大树每株采20张叶片，从同一株树上采集的所有叶片为一个样品，样品保湿后装入可密封塑料袋中，5 d内送实验室检验。 监测取样 采取Z字型五点取样法，每个点选取3株，每株分东南西北四个方位采集叶片，树苗每方向采1张叶片，大树每方向采5张叶片，从同一株树上采集的所有叶片为一个样品，样品保湿后装入可密封塑料袋中，5 d内送实验室检验。 柑橘溃疡病菌分子鉴定(PCR) 试剂 除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用高压灭菌的无菌容器分装。 无菌超纯水 ddH2O PCR缓冲液[× 10，含15 mM Mg2+] 特异性引物对[10 μM] dNTPs[2.5 mM each] Ta