β-乳球蛋白抗原表位谱的解析及关键抗原表位串联体的重组表达与鉴定-临床医学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 必威体育官网网址 ，在 年解密后适用本授权书。 本论文属于  不必威体育官网网址 。 （请在相对应的方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名 ： 日期： 年 月 日 天津医科大学硕士学位论文 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的： 血清特异性 IgE 是诊断食物过敏的重要手段，标准化已知抗原是研制体外特 异性 IgE 诊断试剂的重要前提，制备食物致敏组分的抗原表位重组蛋白是解决抗 原标准化的重要措施。本研究以牛奶中最重要的过敏原“β-乳球蛋白”为例，从 分析其抗原表位入手，分析重要抗原表位与患者血清 sIgE 的反应频率，从而筛 选出其关键抗原表位并构建关键抗原表位重组体，尝试采用抗原表位重组体替 代天然蛋白的可能性。 方法： （1）β-乳球蛋白关键抗原表位筛选及其血清异质性分析：首先在 NCBI 数 据库查得牛奶 β-乳球蛋白的氨基酸序列（162 个氨基酸），用末端重叠的方法合 成 β-乳球蛋白的多肽，然后用斑点印迹的方法，以 20 例牛奶过敏患者血清中的 特异性 IgE 作为一抗，观察多肽与牛奶过敏患者的反应频率有无差异及不同个体 间所识别的多肽有无差异。 （2）β-乳球蛋白关键抗原表位串联重组体的构建及其初步应用研究：将反 应频率最高的 3 个多肽进行串联表达，相邻两个多肽之间用一个甘氨酸做接头， 首先用 DNAStar 生物信息学软件对 3 个表位的 6 种组合方式进行预测，选出最 佳组合方式；委托上海生工生物有限公司合成关键抗原表位串联体的 DNA 序列， 并与 pET-42a（+）质粒载体进行连接，将构建好的质粒转化到 BL21（DE3）感 受态细胞中，用 IPTG 诱导剂进行诱导表达，最后利用镍柱纯化出单一组分的关 键抗原表位串联体重组蛋白，最后采用 western-blot、斑点印迹方法和活性氧传 递均相发光免疫测定技术鉴定重组蛋白的免疫学活性。 结果： （1）患者血清中 sIgE 所识别抗原表位的异质性分析：在 20 例牛奶过敏患 者血清的斑点印迹结果中有一部分血清所识别的多肽相同，如 1 号、5 号、6 号、 11 号牛奶过敏患者血清所识别的表位均为 1 号多肽，有一部分牛奶过敏患者血 清所识别的表位均不完全相同。根据多肽反应频率的不同，筛选出 β-乳球蛋白 I 最主要表位的氨基酸序列为 AA76-95、AA1-20、AA106-125，主要表位的氨基 酸序列为 AA91-110、AA61-81、AA121-140，次要表位的氨基酸序列为 AA 46-65、 AA 31-50、AA 151-162。 （2）β-乳球蛋白关键抗原表位串联体重组蛋白的表达及鉴定：通过 DNAStar 软件对理论上 6 种组合方式进行了分析，得到最佳组合方式，成功构建了大肠 杆菌原核表达载体，IPTG 诱导表达后，获得大小为 36kDa 左右的融合蛋白，并 纯化得到单一组分的 36kDa 大小的重组蛋白，并经免疫印迹法、斑点印迹法鉴 定其免疫活性，并利用重组蛋白作为检测抗原建立了一种活性氧传递均相发光 免疫测定技术来检测血清 sIgE。 结论： 本研究对牛奶主要过敏原 β-乳球蛋白的抗原表位进行了解析，不同牛奶过 敏患者血清所识别的抗原表位具有异质性。成功表达了 β-乳球蛋白关键抗原表 位串联体重组蛋白，并鉴定了关键抗原串联体重组蛋白具有良好的免疫学活性， 在检测牛奶过敏疾病中有可能代替天然抗原，为新一代诊断试剂的制备奠定基 础。 关键词：牛奶过敏 β-乳球蛋白 特异性 IgE 抗原表位 重组表达 II Abstract Objective: Serum specific IgE is a common means of diagnosis of food allergy, Standardization of known antigen is the important precondition for development of specific IgE in vitro diagnostic re