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植物生理研究技术 实验报告 实验二 叶绿体的分离制备及 希尔反应活力测定 一、实验目的 本实验学习分离制备叶绿体的技术方法，加深对希尔反应的理解及对光反应的认识。 二、实验原理 英国生物化学家R．Hill(1937年)首先将离体叶绿体加入有适当氢受体(如草酸高铁钾盐、2，6一二氯酚靛酚、NAD+和NADP+)的水溶液中，照光后即有O2放出，这就是水的光解，即希尔反应。制备离体叶绿体和测定希尔反应活力是研究叶绿体结构和光反应必不可少的。 叶绿体的分离采用离心分级分离，即利用叶绿体的直径和沉降系数与其他细胞器不同的特点，先用低速离心除去细胞碎片，后用高速离心沉降叶绿体。希尔反应活力的测定是将叶绿体加入铁氰化钾，并照光，水被光解放氧，而溶液中的Fe(CN)63-被还原成Fe(CN)64+，后者可使FeCl3。变成游离的Fe2+，而Fe2+又可与邻菲啰啉盐生成橙红色的络合物，并且Fe2+的浓度与颜色深浅呈线性关系，因而可比色测定。其反应如下： 三、实验材料、设备和试剂 1．实验材料 新鲜菠菜叶片 2．设备 (1)分光光度计 (2)台式离心机 (3)研钵 (4)照光装置 (5)试管 (6)移液管 (7)烧杯 (8)纱布 3．试剂 (1)叶绿体提取液(STN)溶液：含有0.4mol·L-1蔗糖、0.05 mol·L1HCI—Tris缓冲 液、0.01 mol·L-1NaCl，用HCl调pH至7.8，贮于冰箱预冷备用。 (2)希尔反应试剂：包括0.5 mol·L-1 Tris缓冲液(pH7．8)、0.05 mol·L-1 MgCl2溶液、0.1 mol·L-1NaCl溶液、0.01 mol·L-1K3Fe(CN)6溶液；上述4种溶液单独分装，不能混合。 (3)显色试剂：0.01 mol·L-1FeCl3溶液(用0.2 mol·L-1醋酸配制)、0.05 mol·L-1邻菲啰啉盐酸盐(C12H18N2·HCl·H2O)溶液(先用少量95%乙醇溶解，后用蒸馏水定容)。 (4)亚铁氰化钾系列溶液：10、20、30、40、50μmol·L-1亚铁氰化钾溶液。 (5)其他试剂：10%三氯乙酸；0.2 mol·L-1柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液；80%丙酮。 四、操作步骤 1．叶绿体的制备 先将叶绿体提取液(STN)、洗净的植物叶片和研钵等玻璃器具放入4℃冰箱中预冷备用。然后称取去柄和去脉叶片10 g剪碎放在置于冰浴中的研钵内，加入预冷提取液20 mL研磨2 min(或在组织捣碎机中捣碎30 s)，再加预冷提取液20～30 mL，4层纱布过滤，滤液装入刻度离心管，先以1 500 r/min离心1 min，上清液转入另一离心管再以4 000 r/min离心4 min，沉淀部分即为叶绿体，加入少量提取液悬浮沉淀物，并定容至4 mL，放冰箱备用。以上过程需在10 min内完成。 2．希尔反应活力的测定 (1)配制反应液：取干洁试管7支(编号)，分别加入希尔反应液中的各种试剂和叶绿体悬浮液各0.1 mL，再分别加入蒸馏水0.5 mL，摇匀。 (2)照光处理：将2支试管放入预先置于方形玻璃标本缸内的有机玻璃试管架上，缸内注入20℃的水保温，另2支试管放在暗处作为对照；用500 W钨灯向标本缸内的试管照光5 min后，立即向所有试管加入10％三氯乙酸0.2 mL终止反应。摇匀后以3000 r/min离心2 min，上清液用于测定Fe(CN)64-。 (3)比色测定：取离心上清液0.7 mL，加水1 mL，再依次加入柠檬酸钠溶液2 mL、FeCl3溶液0.1 mL、邻菲啰啉盐酸盐0.2 mL，摇匀后室温下暗处静置20min，于520 nm下比色。 3．标准曲线绘制 取干洁试管7支(0～6号)，分别加入0(水、空白)、10、20、30、40、50μmol·L-1亚铁氰化钾系列溶液各1.7 mL，其他试剂及操作步骤与样品比色测定相同，记录OD值，绘出标准曲线。 4．叶绿素含量测定 取叶绿体悬浮液0.1 mL，装入离心管，加入80%丙酮4.9 mL，摇匀后以4000r/min离心5 min，取上清液于652 nm下比色，记录OD值，并用Arnon公式计算叶绿素含量 五、注意事项 1．三氯化铁和邻菲啰啉盐酸盐配制后应放在棕色瓶中。 2．测定希尔反应时尽量避光，尤其是加入邻菲啰啉盐酸盐后应在暗处静置，方才比色。 六、结果处理 式中：A 一一希尔反应活力[μmol·L-1K4Fe(CN)63- ·(mg叶绿素·h1)]； b一一标准曲线查得Fe(CN)