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电泳技术 （二） 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE） 一）基本原理 聚丙烯酰胺凝胶由 单体的丙烯酰胺 （CH2=CHCONH2 Acrylamide）和 甲叉双丙烯酰胺 （CH2(NHCOHC=CH2)2 N,N’-methylenebisacrylamide） 聚合而成. 化学聚合和光聚合 化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基： 以R?代表自由基，M代表丙烯酰胺单体，则聚合过程可以表示为： 聚合反应催化剂配伍 单体和双体在凝胶中的总浓度（T） a代表单体的重量（g）；b代表双体的重量（g）；m代表溶液中的体积（ml） 交联度（c）双体占总浓度的百分含量 实验中最常用的交联度 交联度为2.6% a : b=30 : 0.8 交联度为3％ a : b=29 : 1 交联度为5％时，筛孔直径最小 a : b=19 : 1 二）聚丙烯酰胺凝胶的优点 ： 可以随意控制 “T”和 “C”，从而得到不同的有效孔径。 高的灵敏度：10－9 ～10－12 mol/L。 电泳时不会产生“电渗”。 可以制得高纯度的单体原料，因而电泳分离的重复性好。 透明度好，便于照相和复印。机械强度好，有弹性，不易碎，便于操作和保存。 无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。 还可以用作固定化酶的惰性载体。 聚丙烯酰胺凝胶电泳用于核酸的电泳时 分离小片断DNA（5～500bp）效果最好，分辨力极高，相差1bp的DNA片断就能分开。 聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可以容纳相对大量的DNA，其不足之处在于：与琼脂糖凝胶相比，其制备和操作更为困难。 Primer extension analysis 三）聚丙烯酰胺凝胶电泳分类 线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳  线性梯度凝胶是指用丙烯酰胺制备具有浓度从上到下呈直线增加，而孔径则从上到下呈直线降低的凝胶柱（或板）。以这种介质进行的电泳。称线性梯度电泳。 阶梯式梯度凝胶则是指用浓度和孔径呈有规律的阶梯式变化的凝胶制成的凝胶柱（或板）。以这种介质进行的电泳称阶梯式梯度电泳。 梯度凝胶的优点： ①梯度凝胶比单一浓度凝胶的分离范围更宽，可以同时分离较大范围分子量的蛋白质。 单一凝胶电泳对于分子量超过其分离范围的蛋白质，过大或过小，都不能分离。 而梯度凝胶孔径范围比单一凝胶大，分子量较大的蛋白质可以在凝胶顶部大孔径部分得到分离，而分子量较小的蛋白质可以在凝胶底部小孔径部分得到分离，所以分子量较大和较小的蛋白质可以同时得到分离。 例如用4％-30％的梯度胶可以分离分子量5万-200万的蛋白质。 ②梯度凝胶可以分辨分子量相差较小，在单一浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。 电泳过程中，蛋白质在梯度凝胶中迁移，经过的孔径越来越小，直到凝胶的孔径不能通透，这样电泳过程中蛋白质就被浓缩，集中在一个很窄的区带中。 而分子量略小的蛋白质可以迁移得更靠前一些，被集中在略前面的区带中。 由于梯度凝胶孔径逐步变小，在蛋白质不能通透的孔径附近对蛋白有浓缩作用，所以电泳后形成很窄的区带，可以分辨出分子量相差较小的蛋白质。 对于太稀的样品，在电泳过程中可以将样品分几次加样，大小不同的蛋白质分子最终都会滞留在其相应的凝胶孔径中而得到分离。 2.根据样品是否变性分 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1).变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小。 电泳的样品中加入含有SDS和?-巯基乙醇的样品处理液，SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂?-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。 SDS与蛋白质结合后，蛋白质－SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。 电泳样品加入样品处理液后，要在沸水浴中煮3-5 min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。 目的蛋白质的表达 蛋 白 纯 化 Non-denaturing Gel Electr