BIFC Bimolecular Fluorescence Complementation双分子荧光互补系统.pptVIP

BIFCBimolecular Fluorescence Complementation Alba Espargaró Colomé Protein Fragment Complementation També anomenats: Interaction trapping. Permeten observar interacció entre prote?nes in vivo. Classes: Ubiquitina Dihidrofolat reductasa Β-galactosidasa GFP (green fluorescent protein) Detection of transient protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation: The Abl-SH3 case M. Morell et al. Proteomics 2007,7,1023-1036 Estudiar en detall la habilitat del mètode BIFC per detectar interaccions transitòries. The Abl-SH3 case Domini SH3:Domini implicat en la regulació negativa de l’activitat quinasa mitjan?ant interaccions transitòries entre prote?nes. C-Abl tyrosine kinase: regula diferenciació cel·lular i apoptosi, sent responsable de molts senyals extracel·lulars (factors de creixement, adhesió cel·lular i citoquines) i intracel·lulars (dany DNA, estrès oxidatiu) Interaccions estudiades Domini SH3 interacciona amb polipèptids rics en prolina, seguint el motiu PXXP: BRCA1: càncer de mama tipus 1 PRDX1: peroxiredoxina p41: pèptid ric en prolina + mutants WT (Tyr4) Tyr4Arg Tyr4Phe Tyr4Trp Tyr4Gly Bimolecular Fluorescent Complementation C-Abl-SH3: fusionada a l’extrem C-terminal (156-238) amb un linker de seqüència SGGGSGGS i clonada en pBAT-4 (ampR) Pèptid p41: fusionat a l’extrem N-terminal (1-155) amb un linker de seqüència SGGGS i clonat en pET28-a(+) (kanR) Transformació de cèl·lules competents d’Escherichia coli BL21(D3) Esquema basat en les estructures obtingudes per X-ray Experiments amb p41 Cèl·lules transformades amb p-Abl-SH3-CYFP o p-p41-NYFP individualment. Fragments individuals de YFP no són funcionals Cèl·lules transformades amb p-Abl-SH3-CYFP i p-p41-NYFP La majoria de les cèl·lules tenen fluorescència. Cèl·lules transformades amb p-Abl-SH3-CYFP i p-NYFP Necessitat de dues prote?nes per la reconstitució de YFP Anàlisi de lespectre d’emissió de fluorescència on s’observa el pic a 523 nm, l’e