质粒提取化电泳检测.docx

质粒DNA的提取、纯化和电泳检测 【实验目的】 1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用； 2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法； 3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理； 4、学习并掌握凝胶的制备方法； 5、学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法； 6、验证E.coli DH5α与E.coli DH5α（pUC19）在含有氨苄培养基上的生长情况并了解其原理。 【实验原理】 1、携带外源基因并将外源基因导入宿主细胞，使之进行扩增和表达的媒介称为载体。在基因工程操作中载体具有以下性质：A.具有自主复制的起点；B.具有多个限制性核酸内切酶的单一识别位点（多克隆位点）；C.具有可供选择的遗传标记；D.具有高拷贝数。 2、质粒 DNA 是原核生物除类核中的染色体 DNA以外 ,细胞质中含有的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小环状双链 DNA 分子 。 除酵母的杀伤质粒为 RNA 外 , 迄今发现的所有质粒均为双链环状DNA 。 多数质粒只有几千个 bp 但也有一些质粒达105bp 以上 ,一般分子量在 ( 4～100) × 106道尔顿范围内 。不同的质粒在细胞内的拷贝数不同。细胞内含有1-3个拷贝的质粒为低拷贝质粒（严紧型复制），当质粒数在10个拷贝以上，为高拷贝质粒（松弛型复制），用于载体构建质粒多为松弛型。 3、pUC19质粒大小约为2.69kb，含有以下构件：来自于E.coli质粒ColE1的松弛型复制起点；氨苄青霉素抗性基因（Ampr）；E.coliβ-半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及编码β-半乳糖苷酶的DNA序列；多克隆位点（MCS）区段。 图1.pUC18/pUC19质粒图谱 4、质粒在细胞内以共价闭合环状DNA的形式存在，呈超螺旋状态（cccDNA）。在抽提质粒DNA的过程中，由于各种因素影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环DNA(ocDNA)，若两条链发生断裂则转变为线状DNA（L DNA）。一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。 5、在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在，细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性和复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的NaAc高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心与复性于溶液的质粒DNA分离。 6、溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A 将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提出去，最后获得纯度较高的质粒DNA。 7、凝胶是支持电泳介质，具有分子筛效应。琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中泳动速度不同。通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。 8、Supercoiled DNA Ladder Marker（浓度：500ng/6μl） 由 8种超螺旋的质粒DNA 构成，DNA Size大小见下表 大小（bp） 2,087 3,049 3,997 5,026 6,122 8,023 10,085 11,849 DNA量（ng） ~ 50 50 50 150 50 50 50 50 上样量 直接上样：6μl 表1. Supercoiled DNA Ladder Marker DNA size 图2. Supercoiled DNA Ladder Marker 在本实验中所提取质粒pUC19大小约为2.69kb，在Supercoiled DNA Ladder Marker范围中。但不在λDNA/Hind ⅢMaker（125bp-23130bp）的分离范围中，所以不能选用λDNA/Hind ⅢMaker。 【实验试剂与仪器】 1、实验试剂：LB培养基，麦康凯培养基，抗生素（氨苄青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，预冷无水乙醇，1×TAE电泳缓冲液，上样缓冲液（6×loading buffer），琼脂糖，溴化乙锭（EB），Supercoiled