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SHH 信号通路对脑胶质瘤干细胞增  殖与分化调控作用的实验研究 第三军医大学附属新桥医院神经外科　 　 杨辉 尹昌林 吕胜青 　中国重庆，400037 一、材料和方法 1.严重联合免疫缺陷小鼠（SCID mouse）4～5周龄，雄性，10～15g。 2.总共收集31例新鲜人脑胶质瘤组织标本，按世界卫生组织（WHO）确立的原则进行病理分型和分级；3例正常对照脑组织标本来源于新桥医院神经外科同期癫痫手术病人。 3.U251胶质瘤细胞株,CHG-5胶质瘤细胞株。 1、 人脑胶质瘤组织和细胞株中脑胶质瘤干细胞 的分离和体外培养，参照Singh等的方法，采用人CD133细胞分选试剂盒，以免疫磁珠法进行。 2、体外培养活细胞数测定， 采用CCK-8试剂盒，以WST-8法进行。 3、 BGSCs增殖与分化过程中 SHH 信号通路基因表达的检测 ：采用RT-PCR法检测； 4、BGSCs增殖与分化过程中 SHH 信号通路蛋白表达的检测 ：采用 Western Blotting和免疫荧光技术检测； 5、细胞周期测定：细胞收集、固定后以PI染色，流式细胞术检测分析； 6、细胞比例测定：细胞收集、固定后行免疫荧光单标染色，流式细胞术检测分析。 CD133+细胞从原标本中的1.8%～29.7%提高到46.8%～88.7%，而相应的CD133-细胞群标本中CD133+细胞比例降至1%以下。 人脑胶质瘤干细胞生长情况 脑胶质瘤干细胞分化过程中 SHH 信号通路蛋白表达情况 1.Western Blotting在分化第3 d可检测到 明显的Shh和Gli-1的表达 ; 2.分化第3 d，CD133、MAP2、GFAP和MBP 染色阳性的细胞均可较强地表达Gli-1；分 化第7 d时4类细胞表达Gli-1明显减弱，部 分细胞不表达Gli-1。 SHH 信号通路对中枢神经系统的发育是必需的。 在体实验：虽然GLI-1基因敲除的小鼠能正常发育，但SHH、Ptch、GLI-2或GLI-3基因敲除的小鼠均在出生前即死亡，并伴有脑部的严重缺陷。 在本课题研究中我们发现：在脑胶质瘤组织和细胞株中均检测到SHH 信号通路关键分子Shh、Gli-1和Bmi-1表达，而正常成人脑组织中则未检测到；对其表达情况进行分析表明，Shh和Gli-1表达与胶质瘤病理分级有关，高级别胶质瘤组织中表达强于低级别胶质瘤组织中表达。 胶质瘤干细胞分化时，Gli-1表达呈逐渐增强，然后逐渐减弱至消失的过程，CD133表达逐渐减弱，MAP2、GFAP和MBP出现表达并逐渐增强，因此，我们推测SHH信号通路蛋白表达可能参与了胶质瘤干细胞分化启动和阶段性调控作用。 总 结 1、不同病理分级的胶质瘤标本和细胞株中均存在一小部分CD133+胶质瘤细胞，具有干细胞的属性，即BGSCs。 2、 SHH信号通路可能与BGSCs干细胞状态和细胞存活维持有关，并参与了BGSCs分化启动和阶段性调控作用。 3、 SHH信号通路可能也对BGSCs移植后致瘤能力有调控作用。 * * Fig 1 HH 信号通路的组成和信号传递过程 A、HH 信号通路的组成和信号传递过程，B、HH 信号对GLI 的调控 图1-1 免疫磁珠法分选前胶质瘤总体及分选后CD133+和CD133-细胞群中CD133+细胞的含量 上排：P1（A 分选前，B CD133+细胞群，C CD133-细胞群） 下排：U251（a 分选前，b CD133+细胞群，c CD133-细胞群） A B C a b c 照片2 肿瘤球经有血清培养基诱导分化4 h ~7 d，肿瘤球首先贴壁并伸出突起（A-4 h），细胞逐步迁移出来呈放射状分布并分化，表型与亲本肿瘤一致（B、C-3 d，D-5 d，E-7 d，F-亲本肿瘤P1例，200×） A