硕士分子生物实验指导.docVIP

实验一 动物组织中DNA的制备与纯化 【 原 理 】 DNA是所有生物体的基本组成物质。真核生物DNA主要存在于细胞核中。制备DNA时应将细胞核膜打破方能释放出来。 细胞中的DNA和RNA分别与蛋白质相结合，形成脱氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在细胞破碎后，这两种核蛋白将混杂在一起。因此，要制备DNA首先要将这两种核蛋白分开。已知这两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度，如在0.15mol/L NaC1的稀盐溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脱氧核糖核蛋白的溶解度则最小（仅约为在纯水中的1%）；而在l mol/L NaCl的浓盐溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在纯水中的2倍，核糖核蛋白的溶解度则明显降低。根据这种特性，调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。因此，在细胞破碎后，用稀盐溶液，反复清洗，所得沉淀即为脱氧核糖核蛋白成分。 分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质成分变性，让DNA游离出来，再用含有异戊醇的氯仿沉淀除去变性蛋白质。最后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，加入95%的乙醇即可从除去蛋白质的溶液中把DNA沉淀出来，获得产品。 当细胞破碎时，细胞内的脱氧核糖核酸酶（DNase）立即开始降解DNA，如果在破碎细胞后不及时采取抑制酶活的措施，最后将会得不到任何DNA。为此，如在本实验中加入柠檬酸盐、EDTA等螯合剂以除DNase必需的Mg2＋离子，使DNase活性降低，并要求整个分离制备的过程均在4℃以下进行，以减少DNase的降解作用，最后加入SDS使所有的蛋白质（包括DNase）变性。当然如果希望获得更大分子的DNA时，则在细胞破碎后，及时加入SDS使蛋白质（包括DNase）变性，并加入蛋白酶K，降解所有的蛋白质成为碎片或氨基酸，及时阻止DNase的降解作用。 DNA分子很大、很长，在水中呈黏稠状，但DNA链的双螺旋结构不宜小角度的折叠，使之DNA分子具有刚性，即分子是僵直的（stiff），小角度的折叠和压挤等剪切力，将使DNA断裂成碎片。为保证获得大分子DNA，操作时应避免急裂振摇，或过大的离心力。转移吸取DNA时不可用过细的吸头，不可猛吸猛放，更不能用细的吸头反复吹吸。 大分子DNA的水溶液呈黏稠状，可以用玻璃棒缠起来。液体DNA只要防止DNase污染和高盐浓度条件下能在液体状态保存；抽干后的固体DNA，性质稳定，可长期保存。 生物体内各部位的DNA是相同的，但取材时以含量丰富的部位为主，如动物的肝脏、脾、肾、血液、精子等。所有材料，必须新鲜及时使用，或放入－20℃冰箱或液氮冷冻保存。 DNA的含量及纯度可用紫外吸收法、定磷法及化学法等测定。 【 试剂和器材 】 一、试剂· 2H20），用约800ml蒸馏水溶解后，调节pH至7.0，最后定容至1 000ml。 2．0.15mol/L NaCl–0.1mol/L EDTANa2溶液：称取8.77g NaCl，37.2g EDTANa2溶于约800ml蒸馏水中，以NaOH调pH至8.0，最后定容至1 000ml。 3．5%（W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：称取5g SDS溶于45%（V/V）100ml的乙醇中。 4．氯仿–异戊醇溶液：按氯仿:异戊醇=24:1配制。 5．pH8.0 TE缓冲液或0.01mol/LNaOH：120mol/L Tris–HCl，lmol/L EDTANa2。或取NaOH 0.4g加蒸馏水至1 000ml。 6．95％（V/V）乙醇1 000ml。 7．75％（V/V）乙醇1 000ml。 二、器材 1．组织捣碎机。 2．玻璃匀浆器。 3．冷冻离心机。 三、材料 1．冰、粗盐。 2．鸡肝脏 【 操 作 】 1．本实验以鸡肝脏作材料（其他动物肝脏也可以）。实验前鸡应饥饿24h以上，以避免糖原的干扰。 2．用烧杯（500m1）放1/3体积的冰，加入少量水及约20g食盐，制成冰盐水。 3．将经过饥饿的鸡剪断颈部放血致死，迅速开腹取出肝脏，称取约1g浸入预先在冰盐水中冷却的0.15mol/L NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液中。除去脂肪、血块等杂物；再用少量溶液反复洗涤几次，直至组织块无血为止。 4．将洗净的组织1-2g剪成碎块。先加入2m1 0.15mol/L NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液，放在组织捣碎机中迅速捣成匀浆，再放入玻璃匀浆器中匀浆2～3次，使细胞充分破碎。最后加入0.15mol/L NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液至5ml。 5．匀浆液在常温 6 000r/min离心15min，弃上清。在沉淀中加入4倍体积冷的0.15mol/L NaCl–0.015 mol/L柠檬酸钠溶液，搅匀，按上述条件，离心弃上清。尽量洗去可溶的部分（目的是什么?）。最后弃去上