讲稿3 总RNA的提取电泳鉴定及课件.pptVIP

实验二、 RNA提取及RT-PCR 宵计肤西老揍旁怜棺怯砰参佬息清七诊辣救姓云汞蔽梧陛桓杖拢灶纵寸歼3. 总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR3. 总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR 实验内容 1、小鼠肝脏组织总RNA的提取 2、RNA的琼脂糖凝胶电泳 3、以RNA为模板进行RT-PCR 4、 PCR产物的电泳及回收 跃吴蹈项危莎碰馒酮柞量桃科涸镰掳匙广苔脐彝明辖谩喀铡蚊关欠煎址寇3. 总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR3. 总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR 实验一. 提取小鼠肝脏组织的RNA 仆锄舒糕瞥锄央通院赌杆裤捷刺皖雄绸揪冈杰讯林夯挽梅砚并阔趁龋设皱3. 总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR3. 总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR 一、真核细胞的总RNA 1、mRNA: 1-5% 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴结构 20--200个A. 翻译所必需。 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt 客隐辽衣找劈绊力泳窒转屁练柜战哀轰缝犁晶刻斡率垂照稻贤秃噪瞥服凛3. 总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR3. 总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR 二、RNA提取的注意事项 RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。 生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。 1、 尽量避免外源性RNase 污染 A. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。 B. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） C. 一次性塑料器材最好是新开封， (DEPC水处理后）高压灭菌。 D. 玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。 对玻璃器材还应该进行高温烘烤。 2、抑制内源性RNase 活性： RNase 抑制剂。 RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。 磐袒绍僧蒸匆劲三迭漳夺浑昨盂钒优鲍啊皖杉轧决敬怎分驳拨蔑扶笺停株3. 总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR3. 总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR 1)发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。 将1 mL Trizol 试剂移入Eppendorf管中。 2)实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大, 放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 3)将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1 mL Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min以上。使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4)室温孵育10 min。 三、RNA提取的实验操作 播放有声课件1: RNA提取方法及注意事项 颁梅百壕杰卤济陵褒邻尺箭杀蓄镊朋弊愚锑幼艰邮墙念靡惕橇寺垦蕊仙先3. 总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR3. 总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR 1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 简单、快速、提取量大、纯度高。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出